徐 欣 劉中文 卜黎明 宋 松 張英華 王嘉禎 朱緒偉

(河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院，河南鄭州 450008)

維生素C(vitamin C，VC)，又稱為抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)，其與脫氫抗壞血酸(dehydroascorbate，DHA)在酶的作用下形成一個氧化還原系統(tǒng)[1]，具有抗氧化作用，并參與許多生物代謝[2]。在家蠶體內(nèi)，VC是重要的必需營養(yǎng)物質(zhì)[3-5]，能夠刺激家蠶攝食[6]，因此在生產(chǎn)上是一些桑葉添加營養(yǎng)劑的重要組成部分，也是家蠶人工飼料中的重要添加物[7]。為進(jìn)一步了解外界添加VC對家蠶幼蟲生長發(fā)育的影響，我們通過體腔注射不同劑量的VC溶液，觀察家蠶生長、化蛹、結(jié)繭等生理變化，并結(jié)合注射后家蠶體內(nèi)VC含量的變化，確定家蠶可承受的添加劑量；同時，根據(jù)楊洋等[8]研究中的家蠶VC合成代謝關(guān)鍵酶——L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯氧化酶(L-gulono-γ-lactoneoxidase，GULO)的基因序列(BmGULO-like1和BmGULO-like2)進(jìn)行表達(dá)量的半定量RT-PCR分析，以了解注射VC后家蠶體內(nèi)VC含量和生長發(fā)育變化的分子機(jī)理，闡述相關(guān)代謝變化的原因，為研究家蠶添食VC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 家蠶品種 菁松×皓月，由河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院繁育提供。

1.1.2 飼養(yǎng)桑葉 采自河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院桑園，5年生湖桑32號夏伐前的桑葉，桑園土質(zhì)為黃棕壤，桑樹種植行距為1.2 m，株距為0.8 m。

1.1.3 主要試劑 VC，粉劑，純度99%，Sigma公司產(chǎn)品；苯基硫脲，粉劑，純度97%，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；抗壞血酸測定試劑盒，總蛋白定量測定試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；動物組織總RNA提取試劑盒(離心柱型)、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)、2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖、GeneGreen核酸染料，均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 UV2600紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司產(chǎn)品；TGL16M高速冷凍離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；9200型PCR儀，Applied Biosystems公司產(chǎn)品；1600凝膠成像儀，上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 家蠶5齡1 d幼蟲體腔注射不同濃度的VC溶液 設(shè)置VC注射劑量梯度為每克家蠶0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg。將VC粉末溶于0.9%的NaCl溶液中分別配制成VC濃度為0.004、0.008、0.016、0.032、0.064 mg/μL的溶液，選取生長狀況相近的5齡1 d的家蠶幼蟲，每頭家蠶的體質(zhì)量約2 g，用微量進(jìn)樣器進(jìn)行體腔注射，每頭家蠶分別注射VC溶液5 μL，對照區(qū)注射同體積的0.9%的NaCl溶液。對照區(qū)和5個處理區(qū)分別注射100頭家蠶。

1.2.2 家蠶生長發(fā)育情況的觀察與調(diào)查 觀察注射后家蠶5齡期和蛹期生長發(fā)育情況，調(diào)查各個處理區(qū)5齡經(jīng)過、結(jié)繭率、死籠率、蟲蛹率、全繭量、繭層量、繭層率。

1.2.3 家蠶體內(nèi)VC含量的測定 根據(jù)上述家蠶生長發(fā)育調(diào)查的結(jié)果，選擇家蠶每克體質(zhì)量注射劑量為0.01、0.02 mg的處理區(qū)，測定家蠶血淋巴和全蠶體的VC含量。分別在注射后0、1、6、12、24、48、72、96 h共8個時間點進(jìn)行取樣，每個血淋巴和全蠶體樣本各取5頭家蠶，在常溫下用玻璃勻漿器對全蠶體進(jìn)行勻漿處理，取樣時在血淋巴和蠶體勻漿中加入少量的97%的苯基硫脲粉劑防止氧化，每個樣品重復(fù)3次，處理后將樣品置于-20 ℃冰箱中備用。然后，按照抗壞血酸測定試劑盒的操作步驟進(jìn)行操作，其中全蠶體樣品提前按照測定試劑盒說明書測定勻漿蛋白濃度，最后用紫外可見分光光度計進(jìn)行VC含量測定。

1.2.4 半定量RT-PCR測定VC代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量變化 昆蟲幼蟲的脂肪體與肝臟功能相當(dāng)，是主要的儲能場所，也有較高的抗壞血酸含量[9]。選取VC合成代謝的關(guān)鍵酶基因BmGULO-like1和BmGULO-like2進(jìn)行相對表達(dá)量變化檢測，根據(jù)1.2.3的結(jié)果選擇對6個處理組注射后1 h和6 h共2個時間點的家蠶脂肪體進(jìn)行取樣調(diào)查，每個樣品取5頭家蠶幼蟲脂肪體，取出后用液氮處理，放在1.5 mL無蓋離心管中并用鋁箔紙包裹，置于液氮罐中暫時保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)動物組織總RNA提取試劑盒(離心柱型)說明書的步驟，在常溫下并配合使用高速冷凍離心機(jī)提取家蠶脂肪體RNA供試，用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)合成cDNA，再用2×Taq PCR MasterMix進(jìn)行半定量RT-PCR測定。 根據(jù)目的基因的cDNA序列，使用Primer 5.0程序設(shè)計符合半定量RT-PCR試驗的特異性引物，內(nèi)參基因選擇柞蠶肌動蛋白基因(ApA)，其擴(kuò)增的引物序列為ApA-F(5′-CCAAAGGCCAACAGAGAGAAGA-3′)和ApA-R(5′-CAAGAATGAGGGCTGGAAGAGA-3′)；BmGULO-like1基因擴(kuò)增的引物序列為BL1-F(5′-GCTCTTGGAGAAAGCGATTG-3′)和BL1-R(5′-CCCGCACTCTGTCGTAAAGT-3′)；BmGULO-like2基因擴(kuò)增的引物序列為BL2-F(5′-GAGGGCCGTTAAAGAGATCC-3′)和BL2-R(5′-CCAAGTGTAGCGTCAACCAA-3′)。擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)后，再72 ℃延伸10 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

PCR產(chǎn)物在TAE電泳緩沖液中，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳0.5 h，經(jīng)GeneGreen核酸染料染色后在凝膠成像儀下觀察拍照?；虻南鄬Ρ磉_(dá)水平以其PCR產(chǎn)物電泳條帶和ApA基因PCR產(chǎn)物電泳條帶的積分光密度(Integrated Optical Density，IOD)比值表示。所有的試驗均重復(fù)3次，試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶5齡1 d幼蟲體腔注射不同劑量的VC對生長發(fā)育的影響

從表1可以看出，在一定劑量范圍內(nèi)，注射VC能明顯縮短家蠶的5齡經(jīng)過，繭層率也有所提高，每克體質(zhì)量注射劑量為0.02 mg的家蠶結(jié)繭率和蟲蛹率比對照高，說明添加一定量的 VC能促進(jìn)家蠶的生長發(fā)育，是否能夠提高家蠶的抗逆性，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的試驗驗證。但是，注射劑量較高時，每克體質(zhì)量注射劑量為0.04 mg和0.08 mg的家蠶結(jié)繭率、全繭量等多個指標(biāo)都比對照差，尤其是每克體質(zhì)量注射劑量為0.16 mg的家蠶5齡經(jīng)過延長較多，推測與注射高劑量的VC擾亂了家蠶體內(nèi)VC代謝有關(guān)，這在后面的基因表達(dá)量試驗中也得到了驗證。其中，每克體質(zhì)量注射劑量為0.08 mg的家蠶死籠率降低，每克體質(zhì)量注射劑量為0.16 mg的家蠶各指標(biāo)有所改善，可能與結(jié)繭率低和個體差異有關(guān)。

表1家蠶5齡1d幼蟲體腔注射不同劑量的維生素C(VC)的生長發(fā)育情況

每克家蠶VC注射劑量/mg5齡經(jīng)過/(d:h)結(jié)繭率/%死籠率/%蟲蛹率/%全繭量/g繭層量/g繭層率/%09:1495.003.1692.002.030.5125.120.019:1193.002.1591.002.010.5426.870.029:0196.002.0894.002.050.5526.830.049:0991.004.4087.001.950.4925.130.089:2088.002.2786.001.930.4623.830.1610:1293.003.2390.002.010.5426.87

2.2 家蠶5齡1 d幼蟲體腔注射不同劑量的VC對血淋巴和蠶體VC含量的影響

根據(jù)前期生長發(fā)育試驗的結(jié)果，注射低劑量的VC能夠促進(jìn)家蠶生長，而對于促進(jìn)作用主要是怎么影響蠶體內(nèi)VC代謝的，我們進(jìn)行了注射不同劑量VC后多個時間點家蠶體內(nèi)VC含量的測定試驗，來了解蠶體的一系列變化。圖1結(jié)果顯示，注射不同劑量的VC后1 h家蠶血淋巴VC含量變化應(yīng)為注射引起；6 h后注射組VC含量較對照組有所提高，由于血淋巴是蠶體生化反應(yīng)的主要場所，此時是注射后促進(jìn)家蠶體內(nèi)VC代謝的主要時間段，這一結(jié)果與家蠶生長發(fā)育試驗的結(jié)果一致；提高的效果在注射VC后72 h消失，這可能與蠶體內(nèi)VC分解代謝增加、合成代謝減少有關(guān)，使蠶體VC代謝趨于穩(wěn)定，后期可以通過測定家蠶體內(nèi)VC相關(guān)代謝酶活性變化進(jìn)行驗證。

圖1 家蠶5齡1 d幼蟲每克體質(zhì)量注射不同劑量VC的血淋巴VC含量變化

圖2為蠶體總VC含量變化，其與血淋巴變化不同，1 h直接影響過后，VC含量均呈下降趨勢且在6 h處理組VC含量高于對照組，這應(yīng)該與注射VC的影響未消失有關(guān)；6 h后注射組較對照組的VC含量有所降低，可能與注射VC抑制體內(nèi)VC合成途徑有關(guān)；至96 h時3組數(shù)值相差不大，說明處理組蠶體通過自身調(diào)節(jié)達(dá)到體內(nèi)VC平衡。蠶體VC含量測定的是單位蛋白質(zhì)內(nèi)的VC含量，注射組含量比對照組低可能與其血淋巴含量較高有關(guān)，不規(guī)律變化可能與蠶體VC代謝調(diào)節(jié)有關(guān)，側(cè)面說明血淋巴VC含量測定結(jié)果較準(zhǔn)確，更能反映VC對蠶體生理變化的影響。

圖2 家蠶5齡1 d幼蟲每克體質(zhì)量注射不同劑量VC的家蠶體內(nèi)VC含量變化

2.3 半定量RT-PCR檢測BmGULO-like1和BmGULO-like2基因表達(dá)量變化

BmGULO-like1和BmGULO-like2基因是家蠶VC合成代謝的關(guān)鍵酶基因，通過半定量RT-PCR的方法檢測體外注射VC對其表達(dá)量的影響，來了解額外添加VC引起的家蠶相關(guān)基因表達(dá)量的變化，試驗結(jié)果如圖3-4所示。從檢測結(jié)果可以看出，2個基因在5齡早期相對表達(dá)量相差不大，在注射1 h后表達(dá)量變化明顯，到6 h后處理組與對照組相差不大；同時，注射較低劑量的VC能夠顯著促進(jìn)2個基因的表達(dá)，說明注射較低劑量的VC能夠加快家蠶體內(nèi)VC的合成，符合VC能夠提高蠶體抗性的功能；當(dāng)家蠶每克體質(zhì)量注射劑量為0.04 mg時VC合成代謝的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量開始下降，可能是體外注射較高劑量的VC產(chǎn)生了拮抗作用，抑制了VC的合成，對于體外注射較高劑量的VC對家蠶體內(nèi)VC的分解代謝是否有影響還需要進(jìn)一步試驗證明；注射過高劑量的VC(每克體質(zhì)量注射劑量高于0.16 mg)，2個基因表達(dá)量在6 h后仍然顯著升高，可能是引起了代謝紊亂所致，與前面注射高劑量VC的家蠶蟲蛹率比對照低，死籠率比對照高的結(jié)果一致。

*表示與對照區(qū)存在顯著差異，**表示與對照區(qū)存在極顯著差異；圖4相同。圖3 家蠶5齡1 d幼蟲每克體質(zhì)量注射不同劑量VC的BmGULO-like1基因相對表達(dá)量

圖4 家蠶5齡1 d幼蟲每克體質(zhì)量注射不同劑量VC的BmGULO-like2基因相對表達(dá)量

3 小結(jié)與討論

本次試驗采用體外注射的方法給家蠶幼蟲添加VC，能夠較直接地觀察其對家蠶的影響，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，家蠶每克體質(zhì)量注射劑量為0.02 mg能夠促進(jìn)家蠶幼蟲的生長發(fā)育、提高抗性，使血淋巴VC含量提高，VC合成代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量顯著升高，是較合適的注射劑量，為幼蟲期營養(yǎng)添加等方面研究提供了參考。注射高劑量的VC會引起家蠶產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，由于注射大量的VC，家蠶體內(nèi)的VC含量劇增，家蠶為將其還原需消耗過多的氧化物質(zhì)，從而導(dǎo)致家蠶體質(zhì)下降、抗性減弱，以至于結(jié)繭率、蟲蛹率、全繭量、繭層量等多個指標(biāo)都較對照差，試驗結(jié)果中VC合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量顯著升高也是VC代謝紊亂的一種表現(xiàn)。