黎代余， 劉洪明， 汪青筑， 陳志怡， 彭永賢

(畢節(jié)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700)

紫穗槐花為豆科植物紫穗槐(AmorphafruticosaL. )的干燥花蕾，具有清熱解毒、涼血止血的作用。紫穗槐在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，其花期與槐花花期基本一致，由于花的形態(tài)與槐花相似，當(dāng)?shù)孛癖姵２杉秤?。范珊珊等[1-2]研究結(jié)果表明，紫穗槐的化學(xué)成分以黃酮為主，此外還含二苯乙烯苷、揮發(fā)油、甘油酯及多糖等成分。姜泓等[3-4]研究發(fā)現(xiàn)，穗槐根提取物具有一定的抗腫瘤、抗病毒、保肝及殺蟲(chóng)等作用。趙昱瑋等[5-6]分別對(duì)紫穗槐根和葉中總黃酮進(jìn)行了提取和純化研究。目前，對(duì)紫穗槐花的研究主要集中在揮發(fā)性成分方面[7-8]，對(duì)其花中黃酮的研究未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，采用單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法相結(jié)合研究紫穗槐花總黃酮的最佳提取工藝，以期為紫穗槐花的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 紫穗槐花 采自貴州省畢節(jié)市雙山鎮(zhèn)歸化村，經(jīng)貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)學(xué)院鑒定為豆科植物紫穗槐(Amorphafruticosa)的干花蕾。

1.1.2 試劑 蘆丁對(duì)照品，中國(guó)食品藥品鑒定研究院；AlCl3、NaAc、HAc、乙醇、甲醇，均為分析純，市購(gòu)。

1.1.3 儀器設(shè)備 Evolution 600型紫外分光光度計(jì)，美國(guó)ThermoFisher公司；十萬(wàn)分之一電子分析天平；超聲機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理

1) 蘆丁對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品約10.88 mg置25 mL容量瓶中，加入甲醇適量，超聲使其溶解，放冷，再加入甲醇至刻度，搖勻即得0.435 2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

2) 紫穗槐花粉末制備。將紫穗槐花凈制后于105 ℃殺青后在60℃條件下干燥。取1.0 kg經(jīng)乙醚處理，揮去乙醚并干燥，粉碎后過(guò)40目篩備用。

1.2.2 最大吸收波長(zhǎng)掃描 參照文獻(xiàn)[9]的方法，精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0 mL和4.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，依次加入1 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液，1 mL pH 5.2的NaAc-HAc溶液，及適量乙醇至刻度，搖勻后靜置10 min，然后取5.0 mL在波長(zhǎng)300～500 nm處用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，得蘆丁的最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液 0 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL及3.0 mL分別置于50 mL容量瓶中，按照1.2.2的操作在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.4 不同因素對(duì)紫穗槐花總黃酮提取的影響

1) 乙醇濃度。試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，即分別加入20%、30%、50%、70%、80%和90%的乙醇溶液。精密稱(chēng)取紫穗槐花粉末2 g各3份，置于250 mL具塞錐形瓶中，按料液比1∶30分別加入不同濃度的乙醇溶液，45kHz 200W超聲提取3次，每次40 min，然后將提取液過(guò)濾、合并、濃縮后用乙醇定溶到100 mL容量瓶中，即得供試品溶液。取1 mL供試品溶液于10 mL容量瓶中，按照1.2.2的操作在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮的提取率。

2) 料液比。試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理，即料液比(g∶mL)分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 及1∶45。精密稱(chēng)取紫穗槐花粉末2 g各3份，置于250 mL具塞錐形瓶中，按不同料液比分別加入濃度80%的乙醇溶液，45 kHz 200 W超聲提取3次，每次40 min，然后將提取液過(guò)濾、合并、濃縮后用乙醇定溶到100 mL容量瓶中，即得供試品溶液。供試品溶液吸光度測(cè)定及總黃酮提取率計(jì)算同上。

3) 提取次數(shù)。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，即提取次數(shù)分別為1次、2次、3次和4次，精密稱(chēng)取紫穗槐花粉末2 g各3份，置于250 mL具塞錐形瓶中，按料液比1∶40加入濃度80%的乙醇溶液80 mL，45 kHz 200 W超聲提取1～4次，每次40 min，然后將提取液過(guò)濾、合并、濃縮后用乙醇定溶到100 mL容量瓶中，即得供試品溶液。供試品溶液吸光度測(cè)定及總黃酮提取率計(jì)算同上。

4) 提取時(shí)間。試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，即提取時(shí)間分別為25 min、30 min、35 min、40 min、45 min及60 min。精密稱(chēng)取紫穗槐花粉末2 g各3份，置于250 mL具塞錐形瓶中，按料液比1∶40分別加入濃度80%的乙醇溶液，45 kHz 200W超聲提取3次，然后將提取液過(guò)濾、合并、濃縮后用乙醇定溶到100 mL容量瓶中，即得供試品溶液。供試品溶液吸光度測(cè)定及總黃酮提取率計(jì)算同上。

1.2.5 最佳提取工藝條件優(yōu)化 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)總黃酮提取得率影響較大的因素，根據(jù)BBK中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert V8.0進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

通過(guò)測(cè)定得蘆丁的最大吸收波長(zhǎng)為403 nm。以吸光度為縱坐標(biāo)(y)，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖1)。根據(jù)不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，擬合得到線(xiàn)性回歸方程為y=24.744x-0.000 8，R2=0.999 1。說(shuō)明，相關(guān)性較好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

Fig.1 The standard curve of rutin

2.2 不同因素處理紫穗槐花總黃酮的得率

從圖2可見(jiàn)，乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)紫穗槐花總黃酮提取率的影響程度不同。

2.2.1 乙醇濃度 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響較大，隨乙醇濃度的增加總黃酮得率呈先增大后減小趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)達(dá)最大，為2.49%；濃度繼續(xù)增大總黃酮得率反面減小。因此，適宜乙醇濃度為80%。

圖2 不同因素處理紫穗槐花總黃酮的得率

2.2.2 料液比 隨料液比增加總黃酮得率呈波動(dòng)增加趨勢(shì)。當(dāng)料液比(g∶mL)為1∶40時(shí)總黃酮得率最高，為2.52%；繼續(xù)增加溶劑總黃酮得率反而減少。因此，適宜料液比為1∶40。

2.2.3 提取時(shí)間 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響較小，在超聲提取40 min時(shí)，總黃酮得率相對(duì)最高，為2.26%。因此，適宜提取時(shí)間為40 min?？紤]時(shí)間和成本的因素，試驗(yàn)將以超聲提取40 min為紫穗槐花總黃酮提取的適宜時(shí)間。

2.2.4 提取次數(shù) 提取次數(shù)是影響總黃酮的重要因素，隨提取次數(shù)增加總黃酮得率呈先增大后減小趨勢(shì)。當(dāng)提取次數(shù)為3次時(shí)，紫穗槐花總黃酮得率最高，為2.51%；次數(shù)繼續(xù)增加提取的總黃酮含量沒(méi)有明顯的變化。因此，試驗(yàn)適宜提取次數(shù)為3次。

2.3 紫穗槐花總黃酮提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，由于提取時(shí)間對(duì)得率影響較小，因此Box-Behnken設(shè)計(jì)以總黃酮的得率為響應(yīng)值(Y)，僅選擇對(duì)總黃酮超聲提取影響較大的因素乙醇濃度(A)、料液比(B)和提取次數(shù)(C)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)(表1)。從表2看出，處理16的總黃酮得率最高，為2.67%；其次是處理3和處理7，均為2.63%；處理10最低，為2.00%。對(duì)影響因素進(jìn)行回歸擬合得到回歸方程：Y=2.62-0.069A+0.045B+0.12C-0.053AB-0.015AC+0.058BC-0.16A2-0.17B2-0.23C2，R2=0.964，表明，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相符度高，誤差小。失擬項(xiàng)P=0.128 0，表明該模型失擬不顯著。同時(shí)，該回歸模型F=20.63，P<0.001，為極度顯著。表明，模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，響應(yīng)值總黃酮得率與所選變量乙醇濃度(A)和提取次數(shù)(C)高度相關(guān)各種因素間存在一定的交互作用，其中，B2、C2為極度顯著項(xiàng)(P<0.001)，C、A2為顯著項(xiàng)。3個(gè)因素的FA、FB和FC分別為10.22、4.38和29.23，其對(duì)總黃酮提取的影響依次為C>A>B。

表1紫穗槐花總黃酮提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

Table 1 The factor and level of response surface experimental design for total flavonoids extraction technology fromA.fruticosaflowers

從圖3可更直觀的看出各因素間的相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。其中，料液比和提取次數(shù)的交互作用最明顯，對(duì)總黃酮得率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線(xiàn)較陡，即隨著料液比和提取次數(shù)的變化總黃酮得率顯著變化；乙醇濃度和料液比對(duì)總黃酮得率的影響較小，表現(xiàn)為曲線(xiàn)較平緩，即隨著料液比和提取次數(shù)的變化總黃酮得率變化較小。由此確定紫穗槐花總黃酮提取工藝條件為乙醇濃度86.99%、料液比為40.67∶1、提取次數(shù)為2.24次。在此條件下，紫穗槐花總黃酮的得率為2.503 4%。綜合考慮時(shí)間和成本等因素的情況下對(duì)工藝進(jìn)行修正，確定最終工藝條件為85%乙醇、料液比為40∶1、提取2次，每次提取時(shí)間40 min。此工藝條件下3次平行試驗(yàn)的結(jié)果表明，紫穗槐花總黃酮的得率為2.516 1%，與理論值的偏差為1.14%。表明，采用響應(yīng)面優(yōu)化的紫穗槐花總黃酮提取工藝條件可靠。

表2紫穗槐花總黃酮提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果

Table 2 The scheme and results of response surface experiment for total flavonoids extraction technology fromA.fruticosaflowers

圖3 2因素交互作用紫穗槐花總黃酮得率的響應(yīng)圖及等值線(xiàn)

Fig.3 Response charts and isograms of two factors’ interaction to total flavonoids yield extracted fromA.fruticosaflowers

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，同時(shí)考慮總黃酮含酚羥基較多、極性較大，所以以乙醇為提取溶劑。在使用Design- Expert軟件進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化時(shí)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)總黃酮提取影響較大的因素乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)回歸方程和軟件分析，得出紫穗槐花提取的最佳工藝為85%乙醇、料液比為1∶40(g∶mL)、提取2次，每次提取時(shí)間40 min。此工藝條件穩(wěn)定可靠。

在考察料液比對(duì)總黃酮得率的試驗(yàn)中，當(dāng)料液比超過(guò)1∶40(g∶mL)后總黃酮得率不斷降低，可能的原因是由于溶劑的增加增大了其他物質(zhì)的溶出，從而影響了黃酮類(lèi)成分的溶出。該試驗(yàn)未采用《中國(guó)藥典》中亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉為顯色劑，是因?yàn)樵诖孙@色條件下，樣品和對(duì)照品沒(méi)有最大吸收波長(zhǎng)。以三氯化鋁為顯色劑，不但在403 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，而且顯色條件穩(wěn)定可靠，可能的原因尚需進(jìn)一步研究。