張洪玲， 趙昶靈， 曾曉玲， 文國松， 徐紹忠， 臧靈飛， 古朝山

(云南農業(yè)大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

云南省文山州生產的三七是享譽世界的三七道地藥材，因其花色苷的合成和積累量存在縱向上的不均勻性，該州大田種植的一年生三七(Panaxnotoginseng)綠紫過渡莖具有奇異的黃金分割式紫化現(xiàn)象，即過渡莖約1/3的莖段呈紫色，且紫色明顯集中于莖上、中部的黃金分割點處[1]。事實上，作為次生產物，花色苷和三萜皂苷均是三七過渡莖的特征性化合物，一方面，過渡莖皮層薄壁組織外側2～3層細胞中積累的花色苷決定了莖的紫色[1-2]，另一方面，與三七其他營養(yǎng)器官一樣，過渡莖也含三七的藥理活性成分三萜皂苷[3]。前期初步研究表明，從頂端至基部，過渡莖中的花色苷和三萜皂苷含量不均一，且在縱向上的變化表現(xiàn)出迥異的趨勢[1,4]，理論上這種現(xiàn)象與可溶性糖和蛋白質之間的相關性應主要源于合成方面的原因，同時該現(xiàn)象也可能與莖的脅迫響應需求有關。從生物合成角度看，三七過渡莖細胞中可溶性糖和蛋白質均應與花色苷和三萜皂苷合成密切關聯(lián)，一方面，在花色苷和三萜皂苷合成途徑共有的成苷反應中，糖是底物之一，即花色苷和三萜皂苷元在爭奪糖時存在競爭效應，故細胞中可溶性糖含量同時制約了花色苷和三萜皂苷的合成與積累量[5-6]，但其制約程度仍不清楚；另一方面，高等植物細胞中的可溶性蛋白質絕大部分是酶，故過渡莖細胞中可溶性蛋白質含量可能與細胞中花色苷和三萜皂苷的合成能力存在差異性相關[7]。此外，在微生態(tài)和脅迫響應的角度，三七過渡莖在縱向上的不同部位面臨紫外光-B強度和病菌種群與數(shù)量等不完全相同，可溶性糖和蛋白質及2種苷因在脅迫響應中的功能差異而以不同數(shù)量共同積累于莖的不同部位，如可溶性糖、可溶性蛋白質和花色苷可發(fā)揮滲透調節(jié)活性[8-9]，可溶性蛋白質和花色苷又同時具備紫外光-B吸收活性[9-10]，而皂苷則主要發(fā)揮抗菌作用[11]。迄今，文山州一年生三七綠紫過渡莖中可溶性糖、可溶性蛋白質、總花色苷和總三萜皂苷含量縱向變化之間的相關性仍為研究空白，因此，筆者等以一年生三七綠紫過渡莖為材料，并以各莖段可溶性糖、可溶性蛋白質、花色苷及三萜皂苷4種化合物含量為研究切入點，通過對三七綠紫過渡莖中4種化合物含量縱向變化之間相關性的分析，解析綠紫過渡莖中花色苷和三萜皂苷合成的關聯(lián)特征及可溶性糖和可溶性蛋白質對花色苷及三萜皂苷合成的差異性貢獻，旨在為三七綠紫過渡莖中花色苷和三萜皂苷合成相關性及三七抗性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集與預處理

2017年9-12月于云南省文山州的苗鄉(xiāng)三七科技有限公司種植園(23°31′48″N，104°19′21″E，海拔1 540 m)采集三七綠紫過渡莖植株。三七以壟作種植，壟寬150 cm，壟高30 cm，壟溝寬30 cm、深20 cm。棚頂及棚四周覆2層黑色聚乙烯遮陽網，棚頂遮陽網距壟面約1.45 m。采樣時，隨機采集健康的綠紫過渡莖植株80株，重復3次(共240株)，將植株假植于紙杯中?；貙嶒炇液?，在葉柄基部剪去復葉、在根莖交界處剪去根狀莖，將地上莖均分為18段，從莖的頂端向基部，依次將莖段編號為1～18；加液氮將莖段研磨成粉，置-80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 三七綠紫過渡莖莖段可溶性糖、可溶性蛋白質、總花色苷和總三萜皂苷含量的測定

1.2.1 可溶性糖 莖段的可溶性糖含量(soluble sugar content，SSC)用硫酸-蒽酮法測定、以蔗糖為標樣[12]，取莖段粉0.200 g，加5 mL水磨成勻漿；轉入25 mL具塞試管，用15 mL水分5次洗滌乳缽；將試管置沸水浴30 min，取出，冷至室溫，過濾、定容至100 mL。

1.2.2 可溶性蛋白質 莖段的可溶性蛋白質含量(soluble protein content，SPC)用考馬斯亮藍G250(Bio-Rad,USA)法測定、以牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich,St. Louis,USA)為標樣[12]，取莖段粉0.200 g，加10 mL水磨成勻漿，定容至100 mL；加5 mL 100 μg/mL G250液進行反應。

1.2.3 總花色苷 莖段的總花色苷含量(total anthocyanin content,TAC)以“色價”度量[13-14]，取莖段粉0.500 g，加含1%濃鹽酸(v/v)的甲醇30 mL磨成勻漿，在黑暗中濾入50 mL容量瓶，定容；檢測濾液在529.8 nm和657.0 nm處的吸光值，分別記為A529.8和A657.0；莖段TAC=(A529.8-0.25A657.0)/g FW。

1.2.4 總三萜皂苷 莖段的總三萜皂苷含量(total triterpenenoid saponin content,TTSC)以香草醛-高氯酸比色法測定，以人參皂苷Rgl(上海源葉生物科技有限公司)為標樣[14]：取莖段粉0.5000 g至25 mL容量瓶中，加75%乙醇20 mL，用超聲波(50 Hz，100 W)處理20 min，過濾、定容至100 mL；取0.3 mL提取液進行后續(xù)反應。

1.3 數(shù)據分析

化合物含量的檢測均重復2次。試驗數(shù)據采用SPSS 20.0進行方差分析和雙因素相關分析。

2 結果與分析

2.1 三七綠紫過渡莖可溶性糖含量的縱向變化特征

從圖1看出，三七綠紫過渡莖可溶性糖含量(SSC)從莖頂端向基部總體表現(xiàn)為逐漸上升的3峰曲線，3個峰分別出現(xiàn)在4、7和11莖段，且莖段11的SSC最高，約為64.68 mg/g FW，而莖段2的最低，約為17.57 mg/g FW。此外，莖段10～18的SSC總和約為444.92 mg/g FW，約為莖段1～8總和的1.89倍。因此，在一年生三七綠紫過渡莖中，可溶性糖主要集中在莖的下半段。方差分析結果顯示，三七綠紫過渡莖SSC在各莖段間的差異達極顯著水平(P<0.01)。

圖1 三七綠紫過渡莖莖段的可溶性糖含量

Fig.1 Soluble sugar content in stem segments of green-purple transitional stem ofP.notoginseng

2.2 三七綠紫過渡莖可溶性蛋白質含量的縱向變化特征

從圖2看出，三七綠紫過渡莖可溶性蛋白質含量(SPC)從莖頂端向基部總體表現(xiàn)為波浪形上升曲線。莖段1的SPC最低，約為0.06 mg/g FW，莖段15的SPC最高，約為1.65 mg/g FW。此外，莖段1～6、7～12和8～13的SPC之和分別為2.27 mg/g FW、7.34 mg/g FW和8.47 mg/g FW。因此，在一年生三七綠紫過渡莖中，可溶性蛋白質主要集中在莖的中、下部。方差分析表明，一年生三七綠紫過渡莖SPC在各莖段的差異達極顯著水平(P<0.01)。

圖2 三七綠紫過渡莖莖段的可溶性蛋白質含量

Fig.2 Soluble protein content in stem segments of green-purple transitional stem ofP.notoginseng

2.3 三七綠紫過渡莖總花色苷含量的縱向變化特征

從圖3看出，三七綠紫過渡莖總花色苷含量(TAC)從莖頂端向基部表現(xiàn)為單峰曲線，峰值出現(xiàn)在莖段7，該莖段TAC約為1.45(A529.8-0.25A657.0)/g FW，即峰出現(xiàn)在莖中上部紫色最集中的黃金分割點處，這與文獻[1]和文獻[15]報道的結果一致。莖段1～9和10～18的TAC總和分別約為10.26(A529.8-0.25A657.0)/g FW和3.31(A529.8-0.25A657.0)/g FW，前者比后者高約209.97%。說明一年生三七綠紫過渡莖的花色苷主要集中在莖的中、上部。方差分析結果顯示，三七綠紫過渡莖TAC在各莖段間的差異達顯著水平(P<0.05)。

圖3 三七綠紫過渡莖莖段的總花色苷含量

Fig.3 Total anthocyanin content in stem segments of green-purple transitional stem ofPanaxnotoginseng

2.4 三七綠紫過渡莖總三萜皂苷含量的縱向變化特征

三七綠紫過渡莖總三萜皂苷含量(TTSC)從莖頂端向基部表現(xiàn)為 “V形”曲線(圖4)。莖段7(莖中上部的黃金分割點處)的TTSC最低，約為0.75 mg/g FW，與文獻[1]和[15]報道的結果一致。莖段1～3、4～13和14～18的TTSC分別約為4.39 mg/g FW、9.46 mg/g FW和7.93 mg/g FW。因此，一年生三七綠紫過渡莖的三萜皂苷主要集中在莖的頂部和基部。方差分析結果顯示，三七綠紫過渡莖不同莖段TTSC的差異未達顯著水平(P>0.05)，說明三萜皂苷在三七過渡莖中的縱向分布趨于均勻。

圖4 三七綠紫過渡莖莖段的總三萜皂苷含量

Fig.4 Total triterpenoid saponin content in stem segments of green-purple transitional stem ofP.notoginseng

2.5 三七綠紫過渡莖莖段可溶性糖、可溶性蛋白、總花色苷和總三萜皂苷含量的相關性

從表1看出一年生三七綠紫過渡莖莖段可溶性糖(SSC)、可溶性蛋白質(SPC)、總花色苷(TAC)和總三萜皂苷(TTSC)4種化合物含量縱向變化之間呈不同的相關性。SSC與SPC、SSC與TTSC及SPC與TTSC之間均呈正相關，但相關性不顯著；SPC與TAC之間呈顯著負相關，SPC與TAC以及TAC與TTSC之間均呈極顯著負相關。

SSC與TTSC的相關系數(shù)(0.449)大于SSC與TAC的相關系數(shù)(-0.738**)，且SPC與TTSC間的相關系數(shù)(0.088)也大于SPC與TAC間的相關系數(shù)(-0.587*)，因此推測，在一年生三七綠紫過渡莖中，可溶性糖和可溶性蛋白質均優(yōu)先貢獻于三萜皂苷合成?；ㄉ蘸腿圃碥找蛟诔绍辗磻写嬖趯μ堑母偁庩P系而表現(xiàn)為含量上的極顯著負相關(-0.772**)[5-6]。

表1三七綠紫過渡地上莖莖段可溶性糖、可溶性蛋白、總花色苷和總三萜皂苷含量的Pearson相關系數(shù)

Table 1 Pearson correlation coefficients between soluble sugar,soluble protein,total anthocyanin and total triterpenoid saponin content in stem segments of green-purple transitional stem ofP.notoginseng

項目 Item可溶性蛋白質含量 SPC總花色苷含量 TAC總三萜皂苷含量 TTSC可溶性糖含量SSC0.440-0.738??0.449可溶性蛋白質含量SPC1-0.587?0.088總花色苷含量TAC1-0.772??

注：**和*分別表示在P<0.01和P<0.05水平上相關性顯著.

Note: ** and * indicate significance of difference atP<0.01 andP<0.05 level respectively.

3 結論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，從一年生三七綠紫過渡莖的頂端到基部，莖的可溶性糖、可溶性蛋白質、總花色苷和總三萜皂苷的含量總體上分別表現(xiàn)為逐漸上升的3峰、波浪形上升、單峰和V形曲線，其中，總花色苷含量的最大值和總三萜皂苷含量的最小值均出現(xiàn)在莖的上、中部即黃金分割點處；可溶性糖含量和可溶性蛋白質含量在各莖段間的差異均達極顯著水平，總花色苷含量差異達顯著水平，而總三萜皂苷含量差異未達顯著水平?？扇苄蕴呛亢涂扇苄缘鞍踪|含量均與總花色苷含量呈負相關、與總三萜皂苷含量呈正相關，總花色苷含量和總三萜皂苷含量之間則呈極顯著負相關。因此，在一年生三七綠紫過渡莖中，可溶性糖和可溶性蛋白質均優(yōu)先貢獻于三萜皂苷的合成。

云南省文山州大田種植三七的營養(yǎng)器官因強烈紫外光-B、低溫和干旱等文山低緯高原的特殊生態(tài)因子而普遍發(fā)生紫化，但地上莖是紫化出現(xiàn)最早、最明顯的器官[16]，而且，一年生三七的綠紫過渡莖還存在神奇的黃金分割式紫化[1,15]。因此，綠紫過渡莖因同時合成花色苷和三萜皂苷而成為探究三七花色苷和三萜皂苷合成相關性的合適器官[1]。但是，對于三七過渡莖，花色苷積累展示的紫化更多地屬于表象層次的、次要的反應，而三萜皂苷的合成是綠紫過渡莖在生存中更深層次的、基本的需要；在細胞、組織層次，花色苷和三萜皂苷分別定位于莖皮層薄壁組織外側和維管束中[1]，這可能是因為綠紫過渡莖在微生境中面臨的病原菌等誘導三萜皂苷合成的脅迫比紫外光-B、低溫和干旱等誘導花色苷合成的脅迫嚴重得多、發(fā)生的頻率高得多或持續(xù)時間長得多[5,11]。

作為次生產物，花色苷和三萜皂苷在三七綠紫過渡莖中的同時合成與積累均是響應脅迫的結果[5-6,11]，但花色苷和三萜皂苷合成存在相關性的生化機制目前還不完全清楚。作為解析生化機制的前提之一，花色苷和三萜皂苷合成生化途徑中的唯一關聯(lián)處是成苷反應，該反應需以糖作為底物之一[5，17]，這意味著綠紫過渡莖細胞中可溶性糖的積累量應與花色苷和三萜皂苷的合成強度相關。同時，催化花色苷和三萜皂苷合成的酶存在于細胞的可溶性蛋白質中[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在三七綠紫過渡莖中，可溶性糖含量和可溶性蛋白質含量均與總花色苷含量呈顯著負相關、與總三萜皂苷含量呈正相關。其中，可溶性糖含量與總花色苷含量呈負相關，與秋冬變色期歐洲鵝耳櫪(Carpinusbetulus)葉片中的情況相反[18]，但可溶性蛋白質含量與總花色苷含量呈負相關卻與秋冬變色期歐洲鵝耳櫪(C.betulus)葉片中的情況一致[18]，這可能是因程龍霞等[18]的研究僅僅涉及花色苷而不涉及皂苷的含量；可溶性糖含量與總三萜皂苷含量呈正相關與無患子(Sapindusmukorossi)果實發(fā)育中的可溶性糖和皂苷含量存在正相關的情況類似[19]，但與發(fā)育的大豆(Glycinemax)種子中可溶性糖和大豆皂苷含量存在顯著負相關的情況相反[20]，此外，可溶性蛋白質含量與總三萜皂苷含量呈正相關也與發(fā)育的大豆(G.max)種子中可溶性蛋白質和大豆皂苷含量存在顯著負相關的情況相反[20]，可能是因KIM等[20]的研究僅僅涉及皂苷而不涉及花色苷的含量。可見，在不同植物中或同株植物的不同器官中，可溶性糖、可溶性蛋白質及總花色苷和總皂苷含量之間的相關性是不一致的。對于花色苷和皂苷同時合成的三七綠紫過渡莖而言，可溶性糖、可溶性蛋白質、總花色苷和總三萜皂苷含量之間的相關性模式具有明顯的特殊性；在三七綠紫過渡莖中，三萜皂苷合成比花色苷合成更強勢，故可溶性糖和可溶性蛋白質均與皂苷在含量上呈正相關，從而使莖中總花色苷含量與總三萜皂苷含量呈極顯著負相關。