魏 躍， 王 棟， 王媛花， 賈思振， 顏志明， 徐婷婷

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400)

矮牽牛(PetuniahybridaVilm.)為茄科矮牽牛屬草本花卉，夏秋季開(kāi)花，色彩豐富，花期長(zhǎng)，具有較高觀賞價(jià)值，適用于花壇、花境及自然式布置，在世界各地廣泛栽培，被喻為“世界花壇花卉之王”。魏躍等[1]曾利用秋水仙素處理二倍體矮牽牛(2n=2x=14)，獲得同源四倍體(2n=4x=28)新種質(zhì)，其生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)于二倍體，株高、莖粗、花瓣直徑等性狀變大，觀賞性增加，顯示多倍體矮牽牛具有較好的應(yīng)用前景。近年來(lái)國(guó)內(nèi)也有一些有關(guān)矮牽牛的細(xì)胞學(xué)研究，蔡華等[2]曾利用根尖進(jìn)行核型分析，并證實(shí)二倍體矮牽牛染色體數(shù)目為2n=14，筆者等[3-4]也對(duì)二、四倍體矮牽牛花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程進(jìn)行過(guò)細(xì)胞學(xué)觀察，但有關(guān)矮牽牛同源四倍體核型分析及有絲分裂等相關(guān)細(xì)胞學(xué)研究還未見(jiàn)報(bào)道。為此，筆者等對(duì)四倍體矮牽牛的核型及有絲分裂進(jìn)行觀察研究，確認(rèn)其核型和有絲分裂的特異性，為同源多倍體細(xì)胞分類、染色體工程等方面研究提供借鑒。另外研究人員對(duì)觀賞花卉進(jìn)行核型研究時(shí)大多都以根尖、芽為材料[5-6]，本試驗(yàn)采用幼嫩柱頭進(jìn)行核型分析，旨在為觀賞花卉的細(xì)胞學(xué)研究提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料矮牽牛四倍體品系09-5，由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院花卉課題組提供，系利用秋水仙素誘導(dǎo)二倍體品種夢(mèng)幻(購(gòu)自浙江虹越花卉有限公司)經(jīng)5～6代選育而成。

1.2 方法

雌蕊染色體制備參考張紅梅等[7]方法進(jìn)行，于夏季晴天早晨8∶00-10∶00點(diǎn)，取長(zhǎng)度0.5～1 cm的幼小花蕾，置于0.002 mol/L 8-羥基喹啉水溶液中預(yù)處理3 h，蒸餾水沖洗3次，卡諾固定液(無(wú)水乙醇與冰醋酸體積比為3∶1)固定24 h，蒸餾水沖洗3次，0.075 mol/L氯化鉀滴滲1 h，蒸餾水沖洗3次，1 mol/L HCl 60℃水浴解離6 min，蒸餾水沖洗3次，分別切取柱頭、花柱和子房部位，用質(zhì)量濃度為1%的醋酸洋紅染色液充分染色后常規(guī)壓片。觀察3種部位的切片各30張，統(tǒng)計(jì)有絲分裂中期分裂相比率(中期細(xì)胞數(shù)目/觀察細(xì)胞總數(shù)目×100%)。

核型分析：從四倍體材料中選5張中期分裂相良好的照片，采用Ikaros染色體圖像分析軟件進(jìn)行染色體核型配對(duì)分析，并參照李懋學(xué)和陳瑞陽(yáng)等[8-9]的植物核型分析標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析測(cè)量，獲得染色體參數(shù)，按STEBBINS[10]的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌蕊染色體觀察最佳部位的篩選

在物鏡(40×)同一視野下，柱頭平均中期分裂相比率為3.8%，花柱和子房分別為1.1%和1.9%。表明四倍體矮牽牛雌蕊中柱頭細(xì)胞處于有絲分裂中期的比率最高，適宜用于進(jìn)行染色體觀察與分析。

2.2 四倍體矮牽牛核型分析

從圖1和表1可知，有絲分裂中期四倍體矮牽牛1～7號(hào)染色體絕對(duì)長(zhǎng)度的變化范圍在4.83～7.62 μm，相對(duì)長(zhǎng)度的變化范圍在11.3%～17.82%，相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)(某染色體長(zhǎng)度/染色體組的平均長(zhǎng)度)[11]在0.79～1.25，其中1～3號(hào)染色體為中長(zhǎng)染色體(M1)，4～7號(hào)染色體為中短染色體(M2)。臂比(長(zhǎng)臂/短臂)變化范圍為1.04～2.43，著絲粒指數(shù)為29.12%～49.04%，1、4、6、7號(hào)染色體為中部著絲粒染色體(m)，2、3、5號(hào)為亞中部著絲粒染色體(sm)，隨體在2號(hào)染色體。

四倍體矮牽牛終變期核型公式為K(2n)=4x=28=16m+12 sm(4SAT)，染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=28=12M1+16M2。染色體長(zhǎng)度比(最長(zhǎng)/最短)比值為1.58，臂比大于2的染色體比例為28.57%，不對(duì)稱系數(shù)為60.23%，為基本對(duì)稱類型，按照STEBBINS[10]核型分類標(biāo)準(zhǔn)，矮牽牛核型分類為2A型屬于較原始類型。

圖1 同源四倍體矮牽牛染色體有絲分裂中期分裂相、核型及核型模式

Fig.1 Mitotic phase, chromosome karyotype and karyotypic pattern of autotetraploidP.hybridachromosomes at mitosis metaphase

表1 同源四倍體矮牽牛染色體的核型參數(shù)

注：*為具隨體的染色體.

Note:*, the chromosome with satellites.

2.3 有絲分裂的異?，F(xiàn)象

同源四倍體矮牽牛雌蕊柱頭體細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中存在少量異?，F(xiàn)象：在間期有微核仁出現(xiàn)(圖2-1)，細(xì)胞發(fā)生頻率為3.17%；有絲分裂早中期姐妹染色單體部分交叉在一起呈鏈鎖狀發(fā)生染色單體交換(sister chromatid exchanges,SCE)(圖2-2) 發(fā)生頻率為0.8%；同源體細(xì)胞染色體配對(duì)成二價(jià)體(圖2-3,2-4) 發(fā)生頻率為3.7%；中期染色體排列在赤道板外(圖2-5)、染色體丟失在細(xì)胞質(zhì)中(圖2-6)、后期出現(xiàn)落后染色體(圖2-7)和染色體橋(圖2-8 )合計(jì)發(fā)生頻率為6.5%，此外還有中期和后期染色體出現(xiàn)凝集粘合(圖2-9,2-10) 發(fā)生頻率為2.9%。四倍體矮牽牛染色體數(shù)目應(yīng)為2n=28，但少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)2n=20(圖2-11)和2n=24 (圖2-12)非整倍體現(xiàn)象，發(fā)生頻率約為1.7%。

注：1為微核仁，2為姐妹染色單體交換(箭頭示)，3、4為體細(xì)胞同源染色體配對(duì)，5為赤道板外染色體，6為丟失染色體，為7落后染色體，8為染色體橋，9、10為凝集粘合，11、12為非整倍體。

Note:1.Micronucleolus; 2.Sister chromatid exchange; 3 and 4.Homoeologous pairing in somatic cell;5.Chromosomes outside the metaphase plate;6.Lost chromosome;7.Laggard chromosomes;8.Chromosome bridge;9 and 10.Chromosome condensation and bonding;11 and 12.Aneuploid.

圖2同源四倍體矮牽牛異常有絲分裂及非整倍體(×1300)

Fig.2 Abnormal mitosis and aneuploid of autotetraploidP.hybridachromosomes (×1300)

3 結(jié)論與討論

根尖是核型分析最常用的材料但對(duì)種子需求量較大，對(duì)結(jié)籽率低種子較少的作物不適用，且需要進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)，過(guò)程繁瑣試驗(yàn)周期長(zhǎng)。在理論上凡有細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)有絲分裂活躍的分生器官、組織都可以進(jìn)行染色體觀察，如陳勁楓等[12]用卷須代替根尖材料對(duì)黃瓜、菜豆和葡萄的染色體進(jìn)行核型分析，蔡華等[13]利用新生子葉對(duì)牡丹進(jìn)行核型分析，張紅梅等[7]利用青花菜雌蕊子房進(jìn)行染色體核型分析。本試驗(yàn)以幼嫩柱頭為材料對(duì)四倍體矮牽牛進(jìn)行核型分析，由于矮牽牛開(kāi)花期較長(zhǎng)，與根尖相比試驗(yàn)材料較多、取材方便且無(wú)需材料的培養(yǎng)準(zhǔn)備，縮短了試驗(yàn)周期，簡(jiǎn)化了流程。染色體進(jìn)行核型分析時(shí)取樣大小也很重要，取材適宜其細(xì)胞分裂指數(shù)往往較高、中期分裂相也多。本試驗(yàn)同源四倍體矮牽牛幼小花蕾長(zhǎng)度為0.5～1 cm時(shí)其中柱頭直徑為0.7～1.5 mm，此時(shí)柱頭中有較多細(xì)胞處于有絲分裂旺盛期，中期分裂相較多,適合進(jìn)行染色體研究。

核仁是真核生物細(xì)胞核特有的結(jié)構(gòu)，并隨著細(xì)胞周期發(fā)生分離和聚合。RISSO-PASCOTTO[14]在臂形草減數(shù)分裂前期I以外的各時(shí)期均觀察到微核仁，認(rèn)為微核仁是由前期的大核仁裂解而來(lái)，是基因發(fā)生自然突變所致。曹清河等[15]則認(rèn)為細(xì)胞分裂周期中前核仁體由于無(wú)法聚合成大核仁而以游離狀態(tài)存在于細(xì)胞中可形成微核仁。李悅有等[16]認(rèn)為微核仁存在狀態(tài)與細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的旺盛程度密切相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，四倍體矮牽牛微核仁的發(fā)生頻率平均為3.17%，高于二倍體的發(fā)生頻率(0.92%)，這可能與多倍體化后蛋白質(zhì)合成旺盛程度增加相關(guān)。微核仁結(jié)構(gòu)的存在有著復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制，其機(jī)理有待進(jìn)一步探討。

姐妹染色單體交換(SCE)是姐妹染色單體在相同位置發(fā)生等位片段交換，如發(fā)生不對(duì)等交換會(huì)導(dǎo)致基因擴(kuò)增或丟失，SCE頻率增加被認(rèn)為是細(xì)胞環(huán)境中高濃度有害物質(zhì)增加導(dǎo)致的，易導(dǎo)致染色體畸變[17]。儀慧蘭等[18]使用NaCl溶液培養(yǎng)大麥幼苗導(dǎo)致根尖細(xì)胞有絲分裂指數(shù)下降，SCE頻率增高且誘發(fā)有絲分裂染色體行為異常。本試驗(yàn)中觀察到姐妹染色單體大片段多位點(diǎn)單體交換異常現(xiàn)象，可能與加倍后細(xì)胞內(nèi)原有結(jié)構(gòu)和功能改變, 導(dǎo)致DNA修復(fù)錯(cuò)誤或抑制修復(fù)頻率增加從而產(chǎn)生SCE[17]。

四倍體矮牽牛有絲分裂過(guò)程存在少量染色體凝集粘合、同源染色體配對(duì)、染色體丟失、赤道板外染色體、落后染色體、非整倍體等異?，F(xiàn)象，而其中丟失和落后染色體、染色體橋可能是導(dǎo)致非整倍體產(chǎn)生的重要原因[19]。對(duì)同源四倍體異常有絲分裂的原因，張紅梅等[7]認(rèn)為可能是由于四倍體染色體加倍打破了二倍體中各種固有的平衡，造成內(nèi)源激素不協(xié)調(diào)和生理生化過(guò)程不正常而造成的；STEBBINS等[10]認(rèn)為同源四倍體有絲分裂不正常分離與染色體加倍造成特定基因位點(diǎn)純合、隱性基因控制性狀有關(guān)。四倍體矮牽牛體細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生異常現(xiàn)象的機(jī)理可能與上述因素相關(guān)但具體機(jī)理尚有待進(jìn)一步探究。