唐俊瑜， 楊潤煥， 王曉春， 曾彩虹， 夏桂林， 藍(lán) 睿， 楊貴樹， 王麗屏*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201； 2.云南省永勝縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 云南 永勝 674200)

仔豬腹瀉是仔豬生長發(fā)育過程中的一種常見疾病，常由于秋冬和初春季節(jié)氣溫驟變，導(dǎo)致仔豬抵抗力下降，誘發(fā)病原體感染，該病發(fā)病率和死亡率均較高。如2010—2011年中國南方10個(gè)省的豬因腹瀉而死亡的數(shù)量超過100萬頭，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。近年來，隨養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展，仔豬發(fā)病率逐漸升高，哺乳仔豬腹瀉發(fā)病率達(dá)54.83%，死亡率為16.27%[2-3]。引起仔豬病毒性腹瀉的3種常見病原是豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PRoV)[4]。

生豬健康養(yǎng)殖對畜牧業(yè)的良性發(fā)展有著極其重要的作用，2018年進(jìn)入秋冬季節(jié)，永勝縣多個(gè)生豬養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶多次出現(xiàn)仔豬腹瀉病例，且一直得不到有效控制，嚴(yán)重影響仔豬的生長發(fā)育。因此，非常迫切需要查明引起腹瀉的各種可能因素，從而為其有效防治提供理論依據(jù)。因此，筆者通過PCR和RT-PCR方法檢測有腹瀉癥狀豬的糞便，從病毒性病原的角度對哺乳仔豬腹瀉綜合征的病因進(jìn)行篩查，為了解當(dāng)?shù)刎i場發(fā)生該病的病因和臨床治療提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1哺乳仔豬腹瀉樣品用肛門拭子采自云南省麗江市永勝縣3個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場和部分散養(yǎng)戶。其中，養(yǎng)殖場A 32份，養(yǎng)殖場B 24份，養(yǎng)殖場C 10份及散養(yǎng)戶22份，一共88份。樣品置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑RNA提取試劑RNAiso Plus Total RNA(TAKARA)；反轉(zhuǎn)錄試劑RI Enzyme Mix、2×ES Reaction Mix(全式金)、2×Trans Taq HiFi PCR Super Mix(全式金)、異丙醇、75%乙醇、氯仿、瓊脂粉、TBE緩沖液、雙蒸水等。

1.1.3主要儀器高速冷凍離心機(jī)、PCR儀器、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)等。

表1 擴(kuò)增PEDV、TGEV和PRoV的特異性引物信息

1.2方法

1.2.1引物合成用于擴(kuò)增PEDV、TGEV、PRoV的特異性引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成，具體信息見表1。

1.2.2樣品處理將采集的肛門拭子浸于生理鹽水(0.9%)中，用力搖晃，使糞便溶于生理鹽水，4℃浸毒過夜，將液體轉(zhuǎn)移到新的無RNAase離心管，4℃、3 000 r/min離心10 min，去除糞便殘?jiān)?，將上清液吸到新的無RNAase離心管中，4℃、10 000 r/min離心10 min后將上清液吸出，用于提取核酸。

1.2.3RNA提取在2 mL離心管中加入處理好的糞便樣品上清液300 μL、RNAiso Plus(TRIZOL)800 μL，上下反復(fù)顛倒使RNAiso Plus(TRIZOL)與樣品混勻，4℃靜置10 min，再加入氯仿溶液160 μL，上下反復(fù)顛倒15 s使兩相徹底混勻，使RNA在水飽和酚的酸性條件下存在有機(jī)相中，4℃靜置10 min，12 000 r/min離心15 min；吸上層無色溶液約500 μL于新的1.5 mL無RNAase的離心管中，加入等量異丙醇，4℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，使RNA沉淀于離心管底部；倒去上清液，向離心管內(nèi)加75%乙醇1 mL清洗，7 500 r/min離心5 min；倒去上清液，輕甩，用吸水紙吸干離心管壁的液體，每管加入DEPC水20 mL溶解RNA，瞬時(shí)離心，取RNA 5 μL加樣到1%瓊脂糖凝膠(含0.2%EB)孔中，150 V 電泳15 min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察提取RNA的完整性，并通過核酸定量儀測定其濃度和純度。

1.2.4RNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄體系10 μL：2×ES Reaction Mix(含10×RT Buffer，dNTPs)5 μL，EasyscriptTM RT/RI Emzyme Mix(反轉(zhuǎn)錄酶，含Rnase Inhibitor) 0.5 μL，下游引物 1 μL，模板RNA 3.5 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：42℃、30 min；85℃、5 min。

1.2.5PEDV、TGEV、PRoV的檢測分別以反轉(zhuǎn)錄好的cDNA為模板，用PEDV、TGEV、PRoV的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TransHiFiII 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，cDNA 1.0 μL。PEDV、TGEV擴(kuò)增程序：94℃、5 min；94℃、30 s，53℃、30 s，72℃、30 s，循環(huán)35次；72℃、5 min；4℃保存。PRoV擴(kuò)增程序：94℃、5 min；94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、30 s，循環(huán)34次；72℃、5 min；4℃保存。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL配制成體系后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠(含0.2%EB)孔中，120 V電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1PCR檢測

利用特異性引物及對應(yīng)的PCR檢測方法檢測88份糞便樣品，并通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。從圖1看出，PEDV的擴(kuò)增片段為199 bp，與預(yù)期目的片段大小相符，表明部分糞便樣品中PEDV檢測呈陽性。TGEV的擴(kuò)增片段為439 bp，與預(yù)期目的片段大小相符，表明部分糞便樣品中TGEV檢測呈陽性。PRoV的擴(kuò)增片段為362 bp，與預(yù)期目的片段大小相符，表明部分糞便樣品中PRoV檢測呈陽性。

圖1PEDV、TGEV 和ProV的RT-PCR擴(kuò)增圖譜

2.2病原陽性率

從表2看出，在檢測的88份樣品中有8份為PEDV陽性，陽性率為9.09%；4份樣品為TGEV陽性，陽性率為4.54%；24份樣品為PRoV陽性，陽性率為27.27%。其中，養(yǎng)殖場A的PEDV陽性3份，陽性率為9.38%；TGEV陽性2份，陽性率為6.25%；PRoV陽性6份，陽性率為18.75%。養(yǎng)殖場B無PEDV陽性；TGEV陽性1份，陽性率為4.17%；PRoV陽性10份，陽性率為41.67%。養(yǎng)殖場C的PEDV陽性1份，陽性率為10.00%；TGEV陽性2份，陽性率為20.00%；PRoV陽性1份，陽性率為10.00%。散養(yǎng)戶無PEDV陽性；TGEV陽性3份，陽性率為13.63%；PRoV陽性7份，陽性率為31.82%。

表2PEDV、TGEV和ProV 3種病原陽性率檢出結(jié)果

2.3混合感染情況

從表3看出，在88份糞便樣品中檢測出36份樣品呈陽性，其中，有3份樣品同時(shí)檢測出TGEV和PRoV病毒，混合感染率為8.33%；有1份樣品同時(shí)檢測出PEDV與PRoV病毒，混合感染率為2.78%；36份樣品中未發(fā)現(xiàn)3種病毒同時(shí)混合感染。養(yǎng)殖場A存在1份TGEV與PRoV混合感染，混合感染率為9.09%；1份PEDV與PRoV混合感染，混合感染率為9.09%，2份混合感染率為18.18%。養(yǎng)殖場B有1份TGEV與PRoV混合感染，混合感染率為9.09%。養(yǎng)殖場C無混合感染。散養(yǎng)戶有1份TGEV與PRoV混合感染，混合感染率為10.00%。

表3陽性病例中的混合感染病例

3結(jié)論與討論

2010年以來，豬腹瀉疾病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PEDV是引起腹瀉的主要致病病原之一[5]。2011年，陳建飛等[6]對我國11個(gè)省市28個(gè)規(guī)?；i場的139份病料進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，TGEV檢出率達(dá)38.1%，PEDV陽性率為54.7%，二者混合感染率為25.9%。2012年，劉孝珍等[7]對全國12個(gè)省(直轄市)共55個(gè)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的豬場病料檢測發(fā)現(xiàn)，PEDV陽性率達(dá)33.33%，同時(shí)與TGEV、PRoV的混合感染率為27.85%，有69.09%的豬場存在PEDV感染。薛瑞雪等[8]于2013年10月至2014年10月對山東省226份豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，PEDV陽性率為34.69%，TGEV為2.21%，PRoV為28.51%。曹恭貌等[9]于2014年9月至2015年3月對四川省130份豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，PEDV陽性率為41.54%，TGEV為11.54%，PRoV為7.69%。龍飛翔等[10]采用多重RT-PCR對2015—2016年廣西190份豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，PEDV陽性率為22.11%，TGEV為30.53%，PRoV為17.89%。永勝縣豬腹瀉病原PEDV陽性率為4.54%，TGEV陽性率為9.09%，PRoV陽性率為27.27%。表明，PEDV、TGEV與PRoV是引起我國豬腹瀉的3種主要病原，且出現(xiàn)混合感染的情況。

仔豬感染PRoV是影響仔豬成活率的主要因素之一，其單獨(dú)發(fā)生或與其他病原混合感染均可致病。近年來，導(dǎo)致仔豬病毒性腹瀉的流行性病毒陽性率在26.5%～75.6%[11]。在永勝縣36份陽性樣品中存在TGEV與PRoV、PEDV與PRoV的混合感染，其中，有3份樣品存在TGEV與PRoV病毒，混合感染率為8.33%；1份樣品存在PEDV與PRoV病毒，混合感染率為2.78%；未發(fā)現(xiàn)PEDV、TGEV與PRoV病毒同時(shí)感染的情況。病毒混合感染加劇了豬群的危害，增加其他病原的感染機(jī)會(huì)，嚴(yán)重影響豬群的正常發(fā)育，同時(shí)增加了防控難度。檢測結(jié)果表明，永勝縣腹瀉仔豬存在多種病毒性疾病的情況，可能還有細(xì)菌性疾病的存在，盡管病毒檢測陽性率相對較低，在當(dāng)前豬病防控的嚴(yán)峻形勢下，有必要加強(qiáng)對豬群的疫病檢測和疫苗免疫。