周 欣 鄭 天 劉俊寧 張紹雨 劉景寧

（1 江蘇省南京市公安局物證鑒定所 江蘇 南京 210001；2 江蘇警官學(xué)院公安科技系 江蘇 南京 210012）

1 引言

目前，國內(nèi)對于新精神活性物質(zhì)的研究較少，而且主要集中在針對新精神活性物質(zhì)原藥的分析與鑒定方面[1-2]，而體內(nèi)生物檢材的提取方法和檢測方法研究，是當(dāng)前毒品犯罪案件偵查中理化檢驗(yàn)工作的重點(diǎn)內(nèi)容。bk-MDMA是卡西酮類新精神活性藥物, 1996年作為臨床抗抑郁和抗帕金森藥物使用，但不久后發(fā)現(xiàn)其具有苯丙胺類毒品的精神活性[3]，會(huì)造成人體一系列的如興奮、焦慮、致幻等心理副作用，使人產(chǎn)生致幻、暴力、自殘等行為[4]。

相較于傳統(tǒng)的液液萃取法來說，新的提取方法在毒品檢驗(yàn)鑒定中發(fā)揮著越來越重要的作用，例如微波萃取法[5]、超臨界萃取法、快速溶劑萃取法[6]等。快速溶劑萃取是一種全自動(dòng)化的萃取技術(shù)，在植物油萃取、分子印跡聚合物、光敏劑、藥物及其他諸多方向的研究中均有應(yīng)用。A S E萃取技術(shù)因是在高溫高壓狀態(tài)下進(jìn)行萃取，其萃取效率比常溫常壓[7]有大幅提升，而且全自動(dòng)化操作也可以避免人為誤差，有利于提高實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性和精密度?？紤]到生物檢材中毒品原體的含量較低，將A S E技術(shù)用于毒品特別是新精神活性物質(zhì)的檢驗(yàn)，有助于提高提取率，并可通過優(yōu)化A S E方法中的各項(xiàng)參數(shù)選取最佳條件。凝膠滲透色譜是一種體積排阻的凈化技術(shù)，早期的GPC只能采用離線方式進(jìn)行凈化，消耗時(shí)間較長，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在線凈化功能，大幅提高了工作效率。GPC-G C/M S又是一種采用P T V大體積進(jìn)樣的設(shè)備，其進(jìn)樣體積是普通G C/M S的5～10倍，因此具有一定的待測化合物的富集效果。

本實(shí)驗(yàn)將A S E提取技術(shù)和高靈敏度的檢測方法GPC-G C/M S結(jié)合對尿液中的bk-MDMA進(jìn)行檢測分析，基本實(shí)現(xiàn)從前處理到凈化，以及檢驗(yàn)過程的全自動(dòng)處理過程。本實(shí)驗(yàn)所建立的A S E-GPC/G C/M S方法可供相關(guān)人員參考使用。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

ASE350型快速溶劑萃取儀（賽默飛公司，美國），QP2010 GPC-GC/MS（島津公司，日本），電子天平（梅特勒公司，瑞士），移液槍（吉爾森公司，法國），高速離心機(jī)（艾本德公司，德國）。

環(huán)己烷、乙酸乙酯（色譜純，MERK，德國），硅藻土（賽默飛公司，美國），尿樣采自健康志愿者（江蘇省南京市公安局物證鑒定中心），bk-MDMA對照品由南京市公安局提供，并用甲醇配制成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.2 儀器條件

2.2.1 加速溶劑萃取條件

萃取溶劑∶ 乙酸乙酯∶ 環(huán)己烷（ V ∶ V ，1∶1）；加熱時(shí)間：5 min；萃取溫度：110℃；循環(huán)次數(shù)：2次；靜態(tài)萃取時(shí)間：5min；沖洗體積：60%；氮?dú)獯祾邥r(shí)間：90s。

2.2.2 在線凝膠色譜條件

GPC色譜柱：Shodex CLNpak EV-200（2.0 mm×150 mm）；流動(dòng)相：環(huán)己烷：丙酮（V∶V，7∶3）；流速：0.1mL/min；柱箱溫度：40℃；紫外檢測器檢測波長：210 nm；進(jìn)樣體積：5μL；采集樣品時(shí)間：3.87～5.87min。

2.2.3 氣相色譜條件

色譜柱：惰性前置柱5m×0.53mm；預(yù)柱：DB-5MS（5m×0.25mm×0.25μm）；分析柱：DB-5MS（30.0m×0.25mm×0.25μm）；柱箱程序升溫：初始溫度82℃（5min）10℃/min280℃（5.2min）；PTV進(jìn)樣口：初始溫度：初始溫度120℃（5min）100℃/min 250℃（23.7min）；壓力程序：120kpa100kpa/min 180kpa（4.4min）-49.8kpa/min120kpa（23.8min）；載氣：氦氣，進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣時(shí)間：7min。

2.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：EI源，70 eV；離子源溫度：230℃；接口溫度：280℃；質(zhì)量范圍：50～500m/z；溶劑延遲時(shí)間：9.5min；掃描速度：1000；間隔：0.50sec；Scan模式采集。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

將10mL不銹鋼材質(zhì)萃取池兩端加上濾膜，從底部裝入硅藻土，加入1 .0mL尿樣，繼續(xù)填裝硅藻土后從頂部加濾膜密封。按照2.2.1條件置于ASE上進(jìn)行萃取。萃取液濃縮揮干，100μL定容供GPCGC/MS分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 ASE萃取條件優(yōu)化

3.1.1 萃取溶劑的選擇

在選取萃取溶劑時(shí)除考量萃取溶劑與目標(biāo)化合物的相似相容性以外，還要兼顧A S E儀器本身的一些特點(diǎn)，例如A S E 350儀器本身不允許使用如乙醚這樣燃點(diǎn)較低的溶劑，或者如丙酮可能會(huì)影響萃取池密封性的溶劑。實(shí)驗(yàn)考察了乙酸乙酯∶環(huán)己烷（V∶V，1∶1）、乙酸乙酯、二氯甲烷3種不同萃取溶劑的回收率，平行萃取5次，數(shù)據(jù)顯示以乙酸乙酯∶環(huán)己烷（ V∶V，1∶1）的平均回收率96.6%，高于乙酸乙酯92.6%和二氯甲烷96.1%，如圖1所示。乙酸乙酯∶環(huán)己烷（V∶V，1∶1）與二氯甲烷的回收率相當(dāng)，但二氯甲烷的毒性較大，綜合考慮回收率、雜質(zhì)干擾和環(huán)境危害等因素，確定乙酸乙酯∶環(huán)己烷（V∶V，1∶1）為本實(shí)驗(yàn)的萃取溶劑。

圖1 ASE萃取溶劑和目標(biāo)化合物回收率關(guān)系

3.1.2 萃取溫度的選擇

萃取溫度是萃取過程中的一個(gè)關(guān)鍵因素，因?yàn)闇囟仍礁咴饺菀灼茐娜軇┡c化合物之間的范德華力、氫鍵引力等，減少了溶劑的粘性和表面張力，從而能夠讓溶劑更好、更快、更有效地萃取目標(biāo)化合物[8]。一般來說，萃取溫度越高提取率越高，但溫度越高雜質(zhì)也會(huì)相應(yīng)增加。實(shí)驗(yàn)考察了萃取溫度在80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃條件下的萃取效果，如圖2所示。結(jié)果證明，隨著溫度的升高，回收率增大，但溫度110℃以上時(shí)回收率增加已不明顯，且相應(yīng)的雜質(zhì)也增加，兼顧兩方面因素，本實(shí)驗(yàn)選擇萃取溫度為110℃。

圖2 ASE萃取溫度與目標(biāo)化合物回收率趨勢

3.1.3 靜態(tài)萃取時(shí)間和循環(huán)次數(shù)選擇選擇

隨著靜態(tài)萃取時(shí)間的增加，目標(biāo)化合物在溶劑中的溶解度也逐步增加，但其效果隨著時(shí)間的延長而逐步減弱。將一次較長時(shí)間的萃取過程分為兩次，期間重新補(bǔ)充新的萃取溶劑，讓目標(biāo)化合物重新到達(dá)一次溶解與解析的動(dòng)態(tài)平衡，將有助于萃取率的提高。而隨著萃取次數(shù)的增加，目標(biāo)化合物已經(jīng)大部分被萃取出，這種增加循環(huán)次數(shù)的方式將無益于萃取率的進(jìn)一步提高，反而會(huì)大幅度增加無效萃取時(shí)間，兼顧效率與效果的關(guān)系，將靜態(tài)萃取次數(shù)選擇為2次。實(shí)驗(yàn)考察了靜態(tài)萃取時(shí)間在5 m i n、10 m i n、15 m i n條件下的萃取效果，數(shù)據(jù)顯示，隨著萃取時(shí)間的增加回收率并未明顯增加，如圖3所示。為達(dá)到時(shí)間短、回收率高的目的，本實(shí)驗(yàn)選擇5 m i n的靜態(tài)萃取時(shí)間。

圖3 ASE萃取時(shí)間與目標(biāo)化合物回收率趨勢

3.1.4 p H值的選擇和氧化鋁的添加

實(shí)驗(yàn)比較了不同p H值條件下的回收率，在p H值7回收率能達(dá)到較高水平，如圖4所示，故選擇中性條件下萃取。實(shí)驗(yàn)還比較了添加中性氧化鋁前后的變化，發(fā)現(xiàn)回收率和色譜圖并未達(dá)到其預(yù)期的凈化效果。

3.2 GPC凈化條件的選擇

凝膠滲透色譜技術(shù)對小分子的目標(biāo)化合物b k-MDMA和尿液中大分子量的雜質(zhì)，通過體積排阻的原理可以加以區(qū)分。大分子量的雜質(zhì)先流出，而小分子量的b k-MDMA后流出，通過分析兩者不同的流出時(shí)間，可以選擇截取合適的時(shí)間段進(jìn)樣，達(dá)到最大限度的凝膠凈化的效果。實(shí)驗(yàn)通過在線凝膠色譜的紫外檢測器對空白尿和b k-MDMA標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，如圖5所示。

圖4 pH值與目標(biāo)化合物回收率趨勢

圖5 空白尿和bk-MDMA的紫外光譜圖

根據(jù)兩者紫外吸收峰可以看出，空白尿中的雜質(zhì)主要在2.55～3.90 m i n流出，而目標(biāo)化合物bk-MDMA主要在3.50～5.50 m i n流出。為達(dá)到凝膠凈化的最佳效果，本實(shí)驗(yàn)考察了3.32～5.32 m i n和3.87～5.87 m i n兩個(gè)不同采集時(shí)間段的GPC凈化回收率及雜質(zhì)去除效果，如圖6、7所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在3.32～5.32 mi n時(shí)間段內(nèi)，b k-MD MA的特征離子m/z 58對應(yīng)的峰面積11906243；在3.87～5.87 m i n時(shí)間段內(nèi)，bk-MDMA的特征離子m/z 58對應(yīng)的峰面積23102309,并且通過總離子流色譜圖也可以看出，在3.87～5.87 m i n時(shí)間段內(nèi)GPC的凈化效果較好。因此，選擇在3.87～5.87 m i n時(shí)間段內(nèi)收集組分，既能保證目標(biāo)化合物有較高的回收率，同時(shí)又可最大程度地避免大分子尿素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的干擾，達(dá)到GPC在線凈化的目的。

圖6 空白尿標(biāo)準(zhǔn)添加GPC凈化不同采集時(shí)間段的總離子流色譜圖

圖7 空白尿標(biāo)準(zhǔn)添加GPC凈化不同采集時(shí)間段的選擇離子流（m/z58）色譜圖

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.3.1 色譜條件的考察

在選定的儀器條件下，目標(biāo)物具有尖銳的色譜峰型，空白尿在此無干擾。bk-MDMA的保留時(shí)間16.8 m i n，特征離子m/z為58、91、121、149、207。

3.3.2 方法的工作曲線和檢出限

按照2.3的實(shí)驗(yàn)方法取空白尿液1 mL，分別加入一定量的bk-MDMA標(biāo)液配制成濃度為0.1、0.5、1.2.5、5 μg/mL的添加樣品進(jìn)行測定，以bk-MDMA的濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，線性回歸方程為Y=264330 X-19451,相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。方法的檢出限（S/N=3）為0.01 μg/mL。

3.3.3 方法的回收率和精密度

按照2.3的實(shí)驗(yàn)方法，取空白尿液加入不同濃度的bk-MDMA標(biāo)液進(jìn)行測定，每種濃度平行5份樣品，其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（R S D）如表所示。由表所示結(jié)果可知，5種濃度的b k-MD MA的回收率在92%～94.7%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）在2.1%～3.8%之間。

表 bk-MDMA在尿液樣品中的加標(biāo)回收率（n=5）和精密度

本實(shí)驗(yàn)采用A S E進(jìn)行尿液的前處理過程實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)操作，有效避免了人工誤差，利用在線GPC-G C/MS進(jìn)行分析，回收率在92%～94.7%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～3.8%之間，方法的回收率和重現(xiàn)性等方法學(xué)指標(biāo)均符合微量分析要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用A S E-GPC/G C/M S測定尿液中bk-MDMA的方法，具有溶劑用量少、回收率高、雜質(zhì)少等特點(diǎn)，特別是方法的在線提取、凈化和檢測過程自動(dòng)化程度高，極大地提高了工作效率，適用于司法案件尿液中bk-MDMA的檢測分析。