郭慧敏，李祎亮，劉 振

（1．天津技術(shù)產(chǎn)權(quán)交易有限公司，天津 300203；2．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津 300192；3．中國食品營養(yǎng)/安全與藥物化學(xué)國際科技合作基地，教育部工業(yè)微生物重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

重樓是百合科重樓屬（Paridis）植物的泛稱。文章所指的重樓為該屬植物云南重樓和七葉一枝花，是中國著名的藥用植物，易生長在潮濕的地方。已證實重樓的活性成分為重樓皂苷類化合物[1－2]。重樓皂苷具有廣譜抗腫瘤活性，以重樓皂苷為主的活性提取物，體內(nèi)外均顯示了很好的抗腫瘤活性，在動物模型上的抑瘤率超過40%[3－5]，可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移[6]。也有研究證實重樓皂苷可通過緩解炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和降低氧化應(yīng)激反應(yīng)達(dá)到抑制腫瘤生長的目的[7]。重樓皂苷I和重樓皂苷Ⅱ（PSⅡ）是重樓皂苷提取物中的主要活性成分，針對重樓皂苷I已有不少研究報道[8－9]。喜樹堿（CPT）是美國化學(xué)家Wall和Wani于1966年首先從喜樹中提取出來的一種五環(huán)吲哚生物堿，1966年首次從中國本土喜樹中分離得到。CPT具有廣譜抗腫瘤作用，被列為近年來發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床的著名植物類抗腫瘤藥之一。肺癌發(fā)病率居中國惡性腫瘤首位，近70%的肺癌患者確診時已經(jīng)為晚期，錯過了最佳治療時機，臨床上主要采用化學(xué)藥物治療，但化療藥均有明顯的毒副作用。文獻(xiàn)報道PSⅡ?qū)δ[瘤細(xì)胞具有很強的細(xì)胞毒作用，但在肺癌方面的研究較少。因此，本文以兩種wt EGFR類型的肺癌細(xì)胞系——人大細(xì)胞肺癌NCI－H460（H460）和人小細(xì)胞肺癌NCI－H446（H446）為模型，選擇臨床上常用的廣譜化療藥物CPT，與PSⅡ聯(lián)合用藥，研究兩種藥物是否具有協(xié)同作用，并確定含有PSⅡ和CPT的最佳配伍用藥方案，對聯(lián)合用藥方案的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及相關(guān)凋亡網(wǎng)絡(luò)通路的作用機制進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 AnnexinV－FITC/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD公司），Anti－tubulin抗體（西格瑪奧德里奇中國有限公司），Anti－Bcl－2抗體、Anti－Bcl－XL抗體（天津三箭生物科技有限公司）。PSⅡ（天津士蘭科技有限公司），CPT（大連美侖生物技術(shù)有限公司），純度均大于98%。H446和H460購自中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所；細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)（含1%的青霉素－鏈霉素溶液，10%的胎牛血清）。細(xì)胞培養(yǎng)每2～3 d更換培養(yǎng)基1次。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物抑瘤實驗 PSⅡ與CPT聯(lián)合抑瘤實驗：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整H460和H446細(xì)胞，細(xì)胞濃度為5×104cell/mL接種于96孔板上，每孔100μL，同時設(shè)置空白孔和對照孔。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為0．031 25、0．062 5、0．125、0．25μmol/L的化合物CPT，0．3、0．6μmol/L的化合物PSⅡ，以及不同濃度配比的CPT聯(lián)合PSⅡ（0．03125∶0．3，0．0625∶0．3，0．125∶0．3，0．25∶0．3，0．03125∶0．6，0．062 5∶0．6，0．125∶0．6，0．25∶0．6），每孔0．5μL，每個藥物濃度設(shè)置3個復(fù)孔?？瞻卓诪閮H含培養(yǎng)基不含有細(xì)胞、二甲基亞砜（DMSO）以及藥物。對照孔僅加入含相同濃度DMSO的培養(yǎng)基作用于細(xì)胞。按照以上方案藥物處理后，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL的噻唑藍(lán)（MTT）溶液20μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。棄去每孔加入100μL DMSO，37℃，放置10 min后，充分溶解，用酶標(biāo)儀（492 nm，參比波長630 nm）測定各孔的吸光度（OD）值，按以下公式計算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞存活率（%）＝（實驗組OD－空白組OD）/（對照組OD－空白組OD）×100%。IC50：半數(shù)有效抑制濃度，即細(xì)胞存活率為50%時的藥物濃度。根據(jù)MTT結(jié)果求直線回歸方程，并計算IC50值。對CPT與PSⅡ的聯(lián)合作用采用CI值法計算，應(yīng)用計算機軟件CompuSyn計算，CI＜1表示兩藥聯(lián)合后具有協(xié)同作用；CI＝1表示兩藥聯(lián)合后具有相加作用；CI＞1表示兩藥聯(lián)合后具有拮抗作用。

1.2.2 細(xì)胞增殖實驗（平板克隆法測定克隆形成率）取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0．25%胰蛋白酶消化，然后把細(xì)胞懸浮在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中備用。將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200個細(xì)胞的梯度密度分別接種含10 mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，使細(xì)胞分散均勻。置37℃，5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）小心浸洗2次。加4%多聚甲醛5 mL固定細(xì)胞15 min。然后去除固定液，加適量GIMSA染色液染10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加1張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)，最后計算克隆形成率?？寺⌒纬陕剩剑寺?shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%，兩株細(xì)胞分為4組，分別為空白組、加入終濃度為0．125μmol/L的CPT組、0．6μmol/L的PSⅡ組，以及兩者聯(lián)合組。

1.2.3 流式細(xì)胞儀AnnexinV－FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁生長后分別向各實驗孔加入加入0．125μmol/L的CPT和0．3、0．6μmol/L PSⅡ單獨和聯(lián)合處理24 h和48 h。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞；將各孔培養(yǎng)液的上清和收集的底部細(xì)胞懸液混合，放入離心機以1 000 r/min離心收集細(xì)胞。用PBS溶液洗細(xì)胞3次后將細(xì)胞團(tuán)塊分散于細(xì)胞凋亡檢測緩沖液中，在避光條件下向細(xì)胞懸液中分別加入Annexin V－FITC和PI，室溫孵育15 min后用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。重復(fù)實驗3次。

1.2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達(dá) 使用Western blot法，研究PSⅡ與CPT聯(lián)合用藥于體外培養(yǎng)肺癌細(xì)胞株的分子藥理學(xué)機制。將兩種肺癌細(xì)胞按5×104cell/mL的細(xì)胞數(shù)量接種于10 mL平皿中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分組加入終濃度為0μmol/L（用0．5%DMSO代替）、0．125μmol/L的CPT和0．3、0．6μmol/LPSⅡ，以考察單獨和聯(lián)合用藥，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書提取蛋白，采用BCA法檢測并調(diào)整各組蛋白的濃度。將等量的蛋白溶液置于12%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，濕法轉(zhuǎn)移蛋白條帶至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉（PBST液稀釋）l h，一抗4℃孵育過夜；二抗室溫孵育1 h，PBST漂洗3次，每次10 min。加顯色底物孵育后，凝膠成像儀采集圖像。Bandscan 5．0凝膠分析系統(tǒng)分析顯影條帶灰度確定蛋白相對表達(dá)量。

1.2.5 統(tǒng)計分析方法 采用GraphPad Prism5軟件統(tǒng)計分析作圖，所有的數(shù)據(jù)采用（x±s）或者百分比，多組間比較采用單因素方差分析方法，組間兩兩比較采用Dunnett’s檢驗，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 PSⅡ聯(lián)合CPT的細(xì)胞毒作用 有研究表明PSⅡ?qū)460和H446細(xì)胞的IC50低于1μmol/L，筆者為了更好地分析PSⅡ聯(lián)合CPT的效果，分別以CPT單獨或CPT和PSⅡ聯(lián)合應(yīng)用于上述兩種細(xì)胞株，考察了其細(xì)胞毒作用。肺癌細(xì)胞采用不同濃度的CPT（0、0．031 25，0．062 5、0．125，以及0．25μmol/L）和PSⅡ（0．3和0．6μmol/L）單獨和聯(lián)合處理48 h，細(xì)胞存活率由MTT測得，見圖1。結(jié)果顯示，藥物處理的細(xì)胞相對DMSO組的細(xì)胞存活率及CPT單獨使用對肺癌細(xì)胞有細(xì)胞毒活性并呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)PSⅡ聯(lián)合CPT時，對肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用強于單獨應(yīng)用CPT。PSⅡ聯(lián)合CPT對H460和H446細(xì)胞的CI＜1，表明具有協(xié)同作用；PSⅡ增加了CPT對肺癌細(xì)胞的敏感性。在隨后的抑瘤分子機制研究中對H460和H446細(xì)胞應(yīng)用的劑量為0．6 μmol/LPSⅡ+0．125μmol/LCPT。

2.2 PSⅡ聯(lián)合CPT的抗細(xì)胞增殖作用 肺癌細(xì)胞采用CPT（0．125μmol/L）和PSⅡ（0．6μmol/L）單獨或聯(lián)合處理48 h后，聯(lián)合用藥效果明顯優(yōu)于單獨用藥組，PSⅡ聯(lián)合CPT對H460和H446細(xì)胞的CI＜1，表明兩種藥物具有協(xié)同抑瘤作用。見圖2。

2.3 PSⅡ聯(lián)合CPT誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用 采用Annexin V－FITC和PI雙染細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡。分別以PSⅡ（0～6μmol/L）、CPT（0．125μmol/L）、PSⅡ－CPT（0．6～0．125μmol/L）處理肺癌細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，Annexin V－FITC和PI雙染，Annexin V－FITC陽性和PI陰性的細(xì)胞為早期細(xì)胞凋亡（Q1－LR）；Annexin V－FITC和PI均陽性的細(xì)胞為晚期細(xì)胞凋亡（Q1－UR）；Annexin VFITC和PI均陰性的細(xì)胞為正常活細(xì)胞（Q1－LL）。聯(lián)合用藥之后，增加了H460、H466細(xì)胞的早期凋亡，尤其是對H466細(xì)胞，凋亡比例為（70．10±3．44）%，見圖3。而對H460細(xì)胞，PSⅡ和CPT聯(lián)合后顯著增加了晚期凋亡。

圖1 PSⅡ和CPT聯(lián)合作用對H460、H446細(xì)胞的細(xì)胞毒作用Fig.1 Cytotoxicity of PSⅡcombined CPT in H460 and H446 cells

圖2 PSⅡ和CPT單獨或聯(lián)合作用于H460和H446細(xì)胞的平板克隆形成實驗結(jié)果Fig.2 Experimental result of PSⅡand CPT combined or single used in H460 and H446 cellsby flat plateclone formation test

2.4 PSⅡ聯(lián)合CPT對肺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路的作用 為了進(jìn)一步研究PSⅡ聯(lián)合CPT的抑瘤協(xié)同作用機制，采用Western blot方法檢測了抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞癌（Bcl）－2和Bcl－XL的表達(dá)情況，同時對蛋白激酶B（AKT）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)酶（ERK）和p38 MAPK磷酸化蛋白的表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，這幾種蛋白參與細(xì)胞凋亡過程。對H460而言，PSⅡ聯(lián)合CPT能明顯上調(diào)p38 MAPK磷酸化和ERK磷酸化的表達(dá)，對AKT磷酸化無明顯作用，并下調(diào)了Bcl－2和Bcl－XL蛋白的表達(dá)。對H446細(xì)胞而言，PSⅡ聯(lián)合CPT后上調(diào)了AKT、p38 MAPK和ERK的表達(dá)，并下調(diào)了Bcl－2蛋白的表達(dá)，對Bcl－XL無明顯作用，見圖4。

圖3 PSⅡ和CPT聯(lián)合給藥對H460和H446細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用Fig.3 Effect of PSⅡcombined CPT treatment indnced apoptosis in H460 and H446 cells

3 討論

食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了一些分子靶向藥物如吉非替尼用于治療晚期NSCLC患者，并確有良好的療效，但是由于這些靶向藥物分子的作用局限性、價格高以及使用一段時間后會產(chǎn)生耐藥，臨床上化療藥物依然在治療肺癌晚期患者占據(jù)主要地位，如CPT類藥物。聯(lián)合用藥是治療疾病過程中常采用的方式，聯(lián)合用藥產(chǎn)生的協(xié)同作用可顯著提高藥物的療效[10－11]。關(guān)于CPT聯(lián)合其他類藥物的研究也多有報道，如聯(lián)合鬼臼毒素和雷公藤甲素對肺癌細(xì)胞系具有協(xié)同作用。前期實驗發(fā)現(xiàn)重樓與姜黃的復(fù)合物與HCPT聯(lián)合對H22肝癌模型呈現(xiàn)協(xié)同作用。重樓皂苷I、PSⅡ是該復(fù)方的主要活性成分，已有研究表明重樓皂苷I對H1299、H520、H460和H446肺癌細(xì)胞系具有很好的細(xì)胞毒作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性，重樓皂苷I聯(lián)合CPT和HCPT對不同肺癌細(xì)胞系呈現(xiàn)不同的作用取決于肺癌的種類[9]。因此，本文研究了PSⅡ聯(lián)合CPT的協(xié)同作用，結(jié)果表明PSⅡ具有化療增敏作用，與CPT聯(lián)合對H460和H446兩種肺癌細(xì)胞系具有協(xié)同作用，由于這兩種細(xì)胞是不同種類的肺癌細(xì)胞系，H460為NSCLC細(xì)胞系，H446屬于SCLC細(xì)胞。CPT作為拓?fù)洚悩?gòu)酶I（Topo I）的抑制劑，能與Topo I－DNA形成復(fù)合物，從而引起DNA復(fù)制過程中DNA單鏈的斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。近期，對CPT作用機制進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)該類化合物對多條信號通路亦有作用，包括線粒體凋亡通路、PP2A調(diào)節(jié)通路、核轉(zhuǎn)錄因子－κB（NF－κB）信號通路等[12]。PSⅡ是一種很強的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，可以通過調(diào)節(jié)多種信號通路如對NSCLC的AKT通路的調(diào)節(jié)以及對SCLC的ERK通路的調(diào)節(jié)。本研究中PSⅡ在低劑量下（0．6μmol/L）并不能引起H460和H446細(xì)胞的凋亡，而CPT單獨使用劑量下能明顯誘導(dǎo)H460和H446細(xì)胞的凋亡比例。當(dāng)PSⅡ與CPT聯(lián)合后能明顯增強兩種肺癌細(xì)胞系的凋亡細(xì)胞比例，這說明PSⅡ能增加CPT對肺癌細(xì)胞系的敏感性。

MAPK和AKT信號通路對來自細(xì)胞外的刺激敏感，AKT活化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，成為腫瘤治療過程中的一個靶點；ERK通常與細(xì)胞的增殖和生長相關(guān)；而p38 MAPK是細(xì)胞應(yīng)激過程中產(chǎn)生的，與細(xì)胞的死亡密切相關(guān)[8，13－15]。本研究發(fā)現(xiàn)PSⅡ聯(lián)合CPT能明顯上調(diào)p38 MAPK磷酸化和ERK的表達(dá)，對AKT磷酸化在不同細(xì)胞中作用不同。以上研究結(jié)果表明PSⅡ聯(lián)合CPT對NSCLC和SCLC的作用機制不同，調(diào)節(jié)不同的信號通路。

線粒體是腫瘤發(fā)生過程中一種重要的調(diào)節(jié)劑，它參與細(xì)胞死亡、氧化應(yīng)激、代謝等過程[16]。許多研究發(fā)現(xiàn)線粒體積極參與到細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，包括調(diào)節(jié)凋亡信號通路、線粒體膜電位的缺失、促凋亡因子細(xì)胞色素C的釋放等[17]。Bcl－2家族是細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)劑，并在細(xì)胞凋亡過程中起到重要作用，能改變線粒體膜電位。Bcl－2家族蛋白可分為兩個亞族，其中一個是抗凋亡蛋白包括Bcl－2和Bcl－XL[18]。本文的研究結(jié)果表明PSⅡ聯(lián)合CPT作用于H460細(xì)胞后，Bcl－2和Bcl－XL的表達(dá)降低。由此推測PSⅡ增敏CPT對H460和H446細(xì)胞的作用機制可能是影響線粒體信號通路產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡。

研究結(jié)果顯示PSⅡ可以作為化療藥物CPT的增敏劑，呈現(xiàn)協(xié)同作用的分子機制是抑制細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，主要的作用通路為激活p38 MAPK信號通路，同時激活A(yù)KT和ERK磷酸化蛋白的表達(dá)。本研究為PSⅡ成為化療藥物治療肺癌的增敏劑提供了實驗基礎(chǔ)，PSⅡ聯(lián)合CPT有望成為治療肺癌的新治療策略。

圖4 PSII聯(lián)合CPT對H460和H446細(xì)胞中Akt、ERK和p38 MAPK磷酸化蛋白以及抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的作用Fig.4 Effect of PSIIcombined with CPT in Akt,ERK and p38 MAPK phosphorylated protein and anti-apptotic protein Bcl-2 and Bcl-XL in H460 and H446 cells