徐先棟，付輝云，陳文靜，章海鑫，饒 毅，周智勇

(江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 南昌 330039)

隨著生活水平的提高，消費(fèi)者對水產(chǎn)品的需求由數(shù)量型轉(zhuǎn)為質(zhì)量型，對優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品的需求越來越迫切[1-2]。水產(chǎn)品品質(zhì)受到養(yǎng)殖水質(zhì)、投喂策略、流通加工等環(huán)節(jié)影響，現(xiàn)有文獻(xiàn)對上述幾種因素與水產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)系多有闡述[3-5]，池塘養(yǎng)殖水產(chǎn)品體內(nèi)含有的優(yōu)勢菌群也是影響水產(chǎn)品品質(zhì)的一大因素[6]，目前相關(guān)報(bào)道較少。江西省南昌市地處長江中下游、鄱陽湖畔、贛江之濱，為魚米之鄉(xiāng)，是我國主要的淡水水產(chǎn)品生產(chǎn)地區(qū)。本文對江西省南昌市周邊地區(qū)的池塘養(yǎng)殖草魚體內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行調(diào)查，探索養(yǎng)殖草魚體內(nèi)優(yōu)勢菌群的種類，對所分離的細(xì)菌進(jìn)行遺傳背景分析，并挑選不同地區(qū)的分離菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，以分析該地區(qū)草魚體內(nèi)優(yōu)勢菌群分布情況及耐藥性，為漁業(yè)生產(chǎn)以及水產(chǎn)品品質(zhì)評估提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

TSA和TSB培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，DNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、DL2000 marker、dNTPs和 Ex Taq酶均購自大連寶生物公司。

1.2 細(xì)菌分離

細(xì)菌樣品采集自江西省南昌市周邊主要水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)，包括蔣巷鎮(zhèn)、羅家集鎮(zhèn)、塘南鎮(zhèn)、南新鄉(xiāng)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)的草魚養(yǎng)殖池塘(圖1)，采樣時間為2016年6～10月。在每個采樣地點(diǎn)分別隨機(jī)取3尾草魚，用滅菌純凈水清洗體表，然后使用75%酒精棉球擦拭體表，在酒精燈焰旁解剖草魚，用TSA平板從魚體肝臟部位分離細(xì)菌，采用劃線分離培養(yǎng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)，于30 ℃培養(yǎng)24 h后記錄結(jié)果。挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌以TSA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)菌。同時將優(yōu)勢菌株培養(yǎng)液與等體積50%甘油混合，于-80 ℃冰箱中長期保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 采樣點(diǎn)示意圖(黑點(diǎn)標(biāo)示為采樣地點(diǎn))

1.3 16S rDNA序列測定與分析

純化后的分離菌經(jīng)振蕩培養(yǎng)24 h后，使用試劑盒提取細(xì)菌總DNA，對病原菌的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測序。PCR引物為：正向引物27F 5′- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，反向引物1492R 5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT-3′，擴(kuò)增目的片段大小約為1.5 kb。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：ExTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L)4 μL，10×PCR緩沖液(含Mg2+)5 μL，正向引物27F(10 μmol/L)1 μL,反向引物1492R(10 μmol/L)1 μL，DNA模板2 μL，加超純水至總體積50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；最后于72 ℃溫育10 min。1%瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定。所測序列通過Genbank同源性比對，鑒定分離菌株。

1.4 ERIC-PCR分型

腸桿菌基因間重復(fù)共有序列(Enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)-PCR特異性引物序列為：正向引物(F):5′-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3′；反向引物(R):5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′。ERIC-PCR反應(yīng)體系為：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L)2 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，TaKaRa ExTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，以滅菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性7 min；90 ℃變性30 s、52 ℃退火1 min、65 ℃延伸8 min，35個循環(huán)；最后于68 ℃溫育16 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80 V，時間2 h，拍照觀察。

1.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

根據(jù)細(xì)菌鑒定結(jié)果，隨機(jī)選取不同地方分離的代表菌株，使用藥敏紙片擴(kuò)散法對選取的菌株進(jìn)行藥敏檢測[7]。方法如下，菌株經(jīng)Muller-Hinton肉湯培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，使用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整細(xì)菌濃度為108CFU/mL。取100 μL菌液，涂布Muller-Hinton瓊脂平板，使用無菌鑷子取藥敏紙片，貼于平板表面，輕壓一下紙片，每個平板均勻貼布6片紙片。30 ℃培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈直徑。參照CLSI藥敏紙片解釋標(biāo)準(zhǔn)[7]，判斷菌株對藥物的敏感性，結(jié)果記為敏感(susceptible，S)，中度敏感(intermediary，I)和抗藥(resistant，R)。共選擇了8類12種藥敏紙片用于實(shí)驗(yàn)(表1)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用Excel 2007軟件進(jìn)行。

表1 藥敏實(shí)驗(yàn)所用藥敏紙片種類

2 結(jié)果

2.1 草魚體內(nèi)細(xì)菌分離結(jié)果

本次對南昌市周邊地區(qū)池塘養(yǎng)殖草魚體內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行分離純化，共得到56株優(yōu)勢菌株，對優(yōu)勢菌株的16S rDNA基因進(jìn)行了擴(kuò)增和測序，得到全部菌株的16S rDNA片段，Genbank登錄號為KY767483～KY767538(表2)。56株菌株16S rDNA基因序列在Genbank中的同源性比對結(jié)果顯示，81%的菌株為不動桿菌屬細(xì)菌，其中34株細(xì)菌鑒定為抗輻射不動桿菌(Acinetobacterradioresistens)，占總菌株數(shù)的61%，8株細(xì)菌鑒定為約氏不動桿菌(Ac.johnsonii)，占總數(shù)的14%，其他不動桿菌屬細(xì)菌包括瓊氏不動桿菌(Ac.junii)、鮑曼不動桿菌(Ac.baumannii)及皮特不動桿菌(Ac.pittii)各1株，占總數(shù)的6%。有7株菌株16S rDNA序列與維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC35624)比較，相似率大于97%，初步鑒定為維氏氣單胞菌[8]，占總菌株數(shù)的12%，另外戴爾福特菌(Delftiatsuruhatensis)2株，芽孢桿菌屬細(xì)菌(Bacillus)及葡萄球菌屬細(xì)菌(Staphylococcus)各1株。

表2 草魚體內(nèi)分離細(xì)菌信息表

注：BL北瀝，CC滁槎，GH國鴻，JX蔣巷，LJ羅家集，NX南新，TN塘南，WA五愛，YH瑤湖。

2.2 ERIC-PCR分型結(jié)果

分離的34株抗輻射不動桿菌ERIC分型結(jié)果(圖2)表明，ERIC-PCR條帶相似，都能擴(kuò)增出約9條條帶，含有一條大小約為1600 bp明顯條帶。約氏不動桿菌ERIC分型結(jié)果表明有4株菌條帶相似，其他3株菌條帶存在差異(圖3)，瓊氏不動桿菌、鮑曼不動桿菌及皮特不動桿菌均擴(kuò)增出約10條條帶(圖3)。7株維氏氣單胞菌ERIC分型結(jié)果表明，各菌擴(kuò)增條帶均不一樣，條帶數(shù)在3～10條不等，多態(tài)性明顯(圖4)。

1-WA16091, 2-WA16092, 3-WA16094, 4-JX16091, 5-JX16094, 6-JX16097, 7-JX16090, 8-JX16095, 9-YH16104, 10-CC16102, 11-LJ16108, 12-LJ16107, 13-LJ16106, 14-LJ16105, 15-LJ16104, 16-LJ16103,17- TN16102,18-TN16101, 19-NX16101, 20-NX16102, 21-NX16103, 22-JX16096, 23-TN16103, 24-TN16104, 25-GH16093, 26-GH16092, 27-LJ16091, 28-GH16091, 29-JX16913, 30-WA16095, 31-JX16914, 32-JX16911, 33-JX16916, 34-JX19915.

圖234株抗輻射不動桿菌ERIC-PCR指紋圖譜

Lnae M：DL2000 Marker；1-JX16093, 2-JX16099, 3-YH16105, 4-CC16101, 5-BL16102, 6-YH16101, 7-CC16103(Ac.Johnsonii); 8-JX16092(Ac.junii), 9-YH16102(Ac.pittii), 10-WA16096(Ac.baumannii)

圖3其他不動桿菌ERIC-PCR指紋圖譜

2.3 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取的17株菌藥敏結(jié)果見表3和圖5。不動桿菌屬細(xì)菌對慶大霉素、丁胺卡那霉素、恩諾沙星敏感，對青霉素耐藥。大部分不動桿菌屬細(xì)菌對對頭孢曲松、四環(huán)素和復(fù)方新諾明敏感，對氨芐西林、氯霉素、氟苯尼考、多粘菌素b耐藥。所有的維氏氣單胞菌對慶大霉素、丁胺卡那霉素、恩諾沙星、頭孢曲松、復(fù)方新諾明、多粘菌素b、氟苯尼考敏感，對青霉素耐藥，絕大部分的維氏氣單胞菌對四環(huán)素、氯霉素類藥物敏感，對氨芐西林耐藥。不動桿菌細(xì)菌耐藥性最高的菌株為NX16101，對6種藥物表現(xiàn)耐藥性，最低的為JX16091，只對青霉素和麥迪霉素兩種藥物耐藥，其余菌株耐藥種類為3～5種不等。維氏氣單胞菌菌株只對2～3種藥物耐藥。

M：DL2000 Marker；1-BL16104, 2-JX16104, 3-BL16103, 4-BL16105, 5-JX16102, 6-YH16103, 7-JX161021

圖4維氏氣單胞菌ERIC-PCR指紋圖譜

3 討論

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖魚數(shù)量占據(jù)比重大大超過捕撈魚類數(shù)量，如2016年全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量6699.65萬t，其中，養(yǎng)殖產(chǎn)量4937.90萬t，占總產(chǎn)品的73.7%[9]，漁業(yè)生產(chǎn)的主要矛盾也已由原來的漁獲物數(shù)量需要同產(chǎn)能不足之間的矛盾，轉(zhuǎn)變?yōu)槿找嬖鲩L的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品需要同優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品數(shù)量不足之間的矛盾，養(yǎng)殖水產(chǎn)品質(zhì)量問題日益引起消費(fèi)者的重視。水產(chǎn)品質(zhì)量受養(yǎng)殖、流通和加工等環(huán)節(jié)中的多種因素影響，其中養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中水產(chǎn)品體內(nèi)所含菌群種類對水產(chǎn)品質(zhì)量影響很大[6]。有些菌群是新鮮魚類正常寄生菌群，對魚肉品質(zhì)影響不大，有學(xué)者對新鮮養(yǎng)殖魚體內(nèi)主要菌群進(jìn)行了研究，表明不動桿菌屬細(xì)菌為新鮮魚體內(nèi)優(yōu)勢菌。如王航[6]從新鮮草魚肉中共分離出58株菌，結(jié)果表明新鮮魚肉中的微生物主要為革蘭氏陰性菌，不動桿菌屬細(xì)菌是新鮮草魚片的化勢菌，占總菌數(shù)的33%。Parlapani等[10]研究了養(yǎng)殖海鱸的初始微生物構(gòu)成，也發(fā)現(xiàn)不動桿菌屬(Acinetobacter)是其優(yōu)勢菌屬。有些菌群對魚品質(zhì)造成很大影響，常常使魚肉腐敗發(fā)臭，為腐敗菌，主要包括氣單胞菌屬(Aeromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和希瓦氏菌屬(Shewanella)細(xì)菌。腐敗草魚中的優(yōu)勢菌群主要為上述幾種腐敗菌[6]。本文從南昌周邊養(yǎng)殖池塘草魚體內(nèi)分離的優(yōu)勢菌株，79%為不動桿菌屬細(xì)菌，較少見腐敗菌及致病菌，表明在草魚養(yǎng)殖階段品質(zhì)較好，可能與南昌周邊地區(qū)位于贛江之濱、鄱陽湖畔，擁有豐富的水資源以及優(yōu)質(zhì)的水質(zhì)環(huán)境有關(guān)。不過，值得注意的是本研究從魚體分離的腐敗菌氣單胞菌屬細(xì)菌的16S rDNA序列與維氏氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株相似度最高，大于97%，很大可能均為維氏氣單胞菌，該菌為一種條件致病菌，在水質(zhì)惡化、水產(chǎn)動物免疫力低等情況下，感染水產(chǎn)動物致動物患病[11-12]。近年來，維氏氣單胞菌病呈現(xiàn)多發(fā)趨勢，已成為我國淡水養(yǎng)殖動物最重要的細(xì)菌性病原之一[13-14]，需要引起重視。

表3 草魚體內(nèi)分離菌對12種抗生素的藥敏結(jié)果

注：S敏感，I中度敏感，R耐藥；判定標(biāo)準(zhǔn)：小于中間數(shù)值為抗藥，中間數(shù)值為中度敏感，大于中間數(shù)值為敏感；數(shù)字為抑菌圈直徑，單位mm；*為維氏氣單胞菌，#為約氏不動桿菌，其他為抗輻射不動桿菌細(xì)菌。

ERIC-PCR是一種常用的細(xì)菌分子分型手段，具有不要求模板序列已知而能直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，同時，由于其引物序列較長，PCR反應(yīng)退火溫度較高，因此能得到穩(wěn)定性好、重復(fù)性高、多態(tài)性豐富的電泳圖譜，可用來區(qū)分同一種類細(xì)菌的不同株(型)[15]。在不動桿菌屬細(xì)菌分型研究中，有學(xué)者應(yīng)用ERIC-PCR技術(shù)對鮑曼不動桿菌(Ac.baumannii)進(jìn)行過分型研究，通過分型可以對細(xì)菌的來源及遺傳特性分類，主要的條帶位置和數(shù)量相同可視為同一個基因型[16]。對抗輻射不動桿菌的分型尚未見報(bào)道，本文研究的抗輻射不動桿菌均為同一個ERIC型，表明本研究所分離的抗輻射不動桿菌可能來源于同一個遺傳型。ERIC-PCR技術(shù)對維氏氣單胞菌分型研究多有報(bào)道[17-19]，該方法是一種針對維氏氣單胞菌分型研究成熟的方法。本文中6株維氏氣單胞菌的ERIC-PCR條帶均不一樣，表明該地區(qū)的維氏菌多態(tài)性比較豐富，不過因本研究所采用的維氏氣單胞菌株數(shù)量較少，不完全代表該地區(qū)的維氏氣單胞菌遺傳性特征。該地區(qū)的維氏氣單胞菌更詳細(xì)的分型以及主要遺傳性菌株研究有待進(jìn)一步發(fā)掘。

圖5 不動桿菌屬細(xì)菌(A)和維氏氣單胞菌(B)對不同抗生素耐藥菌株數(shù)分析

抗輻射不動桿菌的藥敏研究較少見報(bào)道，同屬的鮑曼不動桿菌因其對人類健康的重要影響——是我國目前最重要的“超級細(xì)菌”[20]，藥敏研究報(bào)道較多[21-22]。本文分離的抗輻射不動桿菌僅表現(xiàn)出對青霉素、麥迪霉素全部抗藥，對多粘菌素b絕大部分抗藥，對其他藥物藥敏或多或少地表現(xiàn)出敏感或全部敏感，為低耐藥性菌株。不過，值得注意的是不同于臨床分離的鮑曼不動桿菌，普遍具有較強(qiáng)的耐藥性而對“非常規(guī)抗生素”多粘菌素均較敏感[21,23]，本文分離的抗輻射不動桿菌對多粘菌素具有較強(qiáng)的耐藥性。推測原因有可能是抗輻射桿菌本身不同于鮑曼不動桿菌的特性，或是南昌周邊地區(qū)的抗輻射不動桿菌由于選擇壓力獲得抗藥性，確切原因有待更多的抗輻射不動桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

本文分離的維氏氣單胞菌均對青霉素表現(xiàn)出耐藥性，對青霉素類藥物耐藥可能是氣單胞屬細(xì)菌的固有耐藥性[24]。對喹諾酮類、氯霉素類、第三代頭孢類藥物敏感，同已有報(bào)道不盡相同[25-27]，可能與維氏氣單胞菌的耐藥性存在地域差別，不同地區(qū)，不同來源菌株耐藥性均不同有關(guān)[13]。本文分離的維氏氣單胞菌耐藥性較低，同作者前期研究嗜水氣單胞菌結(jié)果相類似[28]，表明南昌周邊地區(qū)草魚養(yǎng)殖抗生素使用比較合理，菌株沒有產(chǎn)生大規(guī)模的多重耐藥性。本文選用了青霉素、氯霉素、丁胺卡那霉素等幾種禁用藥物進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，僅用于研究菌株的耐藥性，不作為生產(chǎn)上病害防治用藥參考。