張建芳，李世勇，韓嬙，羅愛(ài)林，任杰

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉學(xué)教研室，武漢 430030；2.濟(jì)南市中心醫(yī)院麻醉科，濟(jì)南 250000)

老年(≥60歲)患者接受全身麻醉手術(shù)后，約41.4%可發(fā)生術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperation cognitive dysfunction，POCD)，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量并增加了社會(huì)醫(yī)療保健負(fù)擔(dān)，目前臨床尚無(wú)有效的防治方法[1]。雖然POCD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但多項(xiàng)研究顯示，全身麻醉藥是引起POCD的主要原因之一[2]。臨床相關(guān)濃度異氟烷可致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素6(IL-6)過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，最終引起認(rèn)知功能障礙[3-4]。脂氧素A4 (lipoxin A4，LXA4)是一類(lèi)重要的內(nèi)源性促炎癥消退脂類(lèi)遞質(zhì)，被稱(chēng)為炎癥反應(yīng)的“剎車(chē)信號(hào)”[5-6]。研究表明，LXA4可通過(guò)血腦屏障，抑制腦缺血及其他神經(jīng)退行性疾病中的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7]。但LXA4能否減輕異氟烷誘發(fā)的老年大鼠海馬神經(jīng)炎癥及認(rèn)知功能損傷尚不清楚。筆者在本研究觀察LXA4預(yù)處理對(duì)異氟烷所致老年大鼠海馬炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠，18～20個(gè)月齡，體質(zhì)量350～400 g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2004-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：NO.4200400243。飼養(yǎng)于溫度(22±1)℃、相對(duì)濕度(60±5)%、明暗各12 h交替(7：00—19：00)通風(fēng)干燥環(huán)境，提供充足的標(biāo)準(zhǔn)化飲食。

1.2藥品與試劑 LXA4 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：437720)，異氟烷購(gòu)自美國(guó)Baxter公司(批號(hào)：N008B008)，核因子κB抑制因子α(nuclear factor of kappa alpha，IκBα)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：BAY 11-7082)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA )試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioSource公司(IL-6批號(hào)：145466017，IL-1β批號(hào)：145530029，TNF-α批號(hào)：145356008)。

1.3儀器與設(shè)備 Biomedical全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x(美國(guó)NOVA公司，型號(hào)：PHOX PLUS)，Ethovision動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡記錄系統(tǒng)(荷蘭Noldus公司，型號(hào)：ETHOVISION PRO)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組與給藥方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將SD大鼠隨機(jī)分為4組(n=30)：對(duì)照組(C組)、異氟烷組(I組)、LXA4+異氟烷組(L+I組)和LXA4組(L組)。異氟烷麻醉開(kāi)始前，L組和L+I組腦室注射0.3 nmol·L-1LXA4 5 μL(溶于0.9%氯化鈉溶液)[7]。C組和I組給予等量0.9%氯化鈉溶液。將大鼠放入麻醉箱中，麻醉箱放入25 ℃恒溫箱內(nèi)與麻醉機(jī)相連，以30%O2-70%N2混合氣體作為載體氣體，通氣流量2 L·min-1。C組和L組大鼠給予30%O2-70%N2混合氣體6 h，I組和L+I組大鼠給予1.4%異氟烷6 h。麻醉完成后關(guān)閉異氟烷揮發(fā)罐，繼續(xù)保持通氣。

1.5動(dòng)脈血?dú)夥治?麻醉結(jié)束后，用32號(hào)針頭立即取左心室血液200 μL，采用Biomedical全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治?，測(cè)定血?dú)庵笜?biāo)和血糖水平。

1.6炎癥因子檢測(cè) 麻醉結(jié)束后，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(麻醉后0，3，6，12和24 h)取大鼠5只，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)海馬TNF-α、IL-1β 和IL-6表達(dá)。

1.7Western blotting檢測(cè)海馬組織蛋白 冰上分離大鼠海馬組織后裂解，提取總蛋白。Western blotting法檢測(cè)海馬組織相應(yīng)蛋白水平。Image Lab 3.0版軟件進(jìn)行灰度分析。以目的蛋白與β-actin灰度值的比值反映其表達(dá)水平。

1.8認(rèn)知功能測(cè)定 待其余大鼠完全清醒后送回籠中，麻醉結(jié)束后第2周參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。Ethovision動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡記錄系統(tǒng)自動(dòng)記錄大鼠游泳軌跡。以大鼠入水至爬上平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期，取每天測(cè)試平均值。將60 s內(nèi)找不到平臺(tái)的大鼠放于平臺(tái)上15 s，逃避潛伏期記為60 s，連續(xù)訓(xùn)練4 d，記錄逃避潛伏期。于第5天將平臺(tái)撤去。從同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠在4個(gè)象限的游泳時(shí)間百分比及穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

2 結(jié)果

2.1異氟烷麻醉對(duì)大鼠循環(huán)和呼吸功能的影響 見(jiàn)表1。4組大鼠血液pH值、二氧化碳分壓(PaCO2)、氧分壓(PaO2)、血糖及氧飽和度(SaO2)比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示異氟烷麻醉對(duì)大鼠循環(huán)和呼吸功能無(wú)影響。

2.2LXA4預(yù)處理改善異氟烷麻醉后認(rèn)知功能 訓(xùn)練的第3天和第4天，與I組比較，L+I組大鼠定位平臺(tái)時(shí)間更短，在目標(biāo)象限時(shí)間百分比更大(P<0.05)。L組與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3LXA4對(duì)異氟烷誘導(dǎo)的海馬內(nèi)炎癥因子水平上調(diào)及IκBα表達(dá)水平下調(diào)的影響 與C組比較，I組麻醉后0，3，6 h海馬內(nèi)IL-1β和 IL-6表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，麻醉12 h后達(dá)基線水平；麻醉后0，3，6，12 h海馬內(nèi)TNF-α表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，麻醉24 h后達(dá)基線水平；麻醉后0，3，6 h海馬內(nèi)IκBα表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，12 h后恢復(fù)正常；與I組比較，L+I組麻醉后0，3，6 h海馬內(nèi)TNF-α、IL-1β和 IL-6表達(dá)下調(diào)，IκBα表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；各時(shí)間點(diǎn)L組和L+I組海馬內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6 及IκBα表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

表14組大鼠動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)和血糖水平比較

Tab.1Comparisonofarterialbloodgasindexandbloodglucoselevelsamongfourgroupsofrats

組別pH值PaCO2PaO2kPaC組7.31±0.054.80±0.5913.97±1.73I組7.33±0.044.83±0.3314.23±1.46L+I組7.32±0.065.16±0.4913.83±1.20L組7.31±0.045.28±0.3114.36±1.60組別血糖/(mmol·L-1)SaO2/%C組4.42±0.3398.87±0.95I組4.58±0.4697.25±0.76L+I組4.25±0.6696.78±0.89L組4.44±0.6199.24±0.73

2.4異氟烷和 LXA4對(duì)海馬內(nèi)IκBα表達(dá)水平的影響 麻醉后2周，與C組比較，I組IκBα表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與I組比較，I+L組IκBα表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。提示異氟烷和 LXA4對(duì)海馬內(nèi)IκBα表達(dá)水平的影響持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)。

3 討論

異氟烷是臨床常用吸入麻醉藥，研究證實(shí)，1.4%異氟烷處理小鼠2，6，24 h后，海馬內(nèi)TNF-α、IL-1和IL-6表達(dá)增高，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥發(fā)生和發(fā)展，損傷學(xué)習(xí)和記憶功能[3，9]。1.4%異氟烷與臨床麻醉所用的濃度接近，筆者在本研究選擇1.4%異氟烷麻醉6 h建立異氟烷誘發(fā)老年大鼠認(rèn)知功能障礙模型。異氟烷處理過(guò)程中，各組動(dòng)脈血?dú)夂脱侵笜?biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明異氟烷未對(duì)循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生明顯抑制。

研究表明，在神經(jīng)退行性疾病中，TNF-α和 IL-1β參與了海馬內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，而阻止TNF-α和 IL-1β釋放可以改善認(rèn)知功能[10]。筆者在本研究發(fā)現(xiàn)，與C組比較，I組麻醉后0，3，6 h TNF-α、IL-1β和 IL-6表達(dá)明顯上調(diào)；麻醉后0，3，6 hIκBα表達(dá)下調(diào)，第3～4天逃避潛伏期延長(zhǎng)，探索時(shí)間縮短。提示1.4%異氟烷可誘導(dǎo)海馬內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6釋放，可能參與誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展，從而導(dǎo)致老年大鼠發(fā)生認(rèn)知功能障礙。

與C組比較，*1P<0.05；與I組比較，*2P<0.05

Compared with group C,*1P<0.05; Compared with group I,*2P<0.05

LXA4是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，在炎癥等病理過(guò)程中具有抗炎和促炎癥消退作用[11]。在諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，LXA4可以通過(guò)抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活、降低炎癥因子(TNF-α、IL-1β)活性等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，與I組比較，L+I組在麻醉結(jié)束后0，3，6 h TNF-α、IL-1β和 IL-6表達(dá)下調(diào)，IκBα表達(dá)上調(diào)，LXA4預(yù)處理可抑制異氟烷誘導(dǎo)的炎癥因子的增加；L組和L+I組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；麻醉結(jié)束后24 h，各組TNF-α、IL-1β及IL-6差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與I組比較，L+I組第3～4天逃避潛伏期縮短，探索時(shí)間延長(zhǎng)，提示LXA4預(yù)處理可減輕異氟烷誘發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，改善異氟烷麻醉誘發(fā)的老齡大鼠認(rèn)知功能障礙。

LXA4能抑制炎性刺激引起的多種細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子表達(dá)，其機(jī)制與抑制NF-κB活性相關(guān)[11]，而IκBα降解是NF-κB釋放的中心環(huán)節(jié)[13]。LXA4抑制TNF-α、IL-1β和 IL-6增加，其機(jī)制可能是抑制IκBα蛋白降解，通過(guò)衰減IκBα降解抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和 IL-6等的釋放，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，改善認(rèn)知功能。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，與C 組比較，I組麻醉后0，3，6 h IκBα表達(dá)下調(diào)，12 h后恢復(fù)正常；與I組比較，L+I組IκBα表達(dá)上調(diào)；L組和L+I組各時(shí)間點(diǎn)IκBα表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A-C.大鼠海馬TNF-α、IL-1β和 IL-6表達(dá)情況；D.大鼠腦內(nèi)IκBα表達(dá)情況；與C組比較，*1P<0.05；與I組比較，*2P<0.05

A-C.expression of TNF-α、IL-1β and IL-6 in hippocampus of rats; D.IκBα expression in hippocampus of rats；Compared with group C,*1P<0.05; Compared with group I,*2P<0.05

圖3水迷宮實(shí)驗(yàn)后2周4組大鼠海馬內(nèi)IκBα表達(dá)情況

Fig.3IκBαexpressioninthehippocampusoffourgroupsofratsafterwatermazetest

綜上所述，LXA4預(yù)處理可減輕1.4%異氟烷致老年大鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與LXA4降低老年大鼠海馬中促炎細(xì)胞因子有關(guān)。