邢逞，張麗，馬林，龔寧波，杜冠華，呂揚(yáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所1.藥物晶型研究中心，晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2.藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，是2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]收載的中藥材品種，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，臨床用于濕溫、暑濕、胎動(dòng)不安等的治療[2]。黃芩藥材作為主要成分被用于安宮牛黃丸、安坤贊育丸、八寶坤順丸、參茸白鳳丸等中成藥[3]，黃芩中藥材質(zhì)量直接關(guān)系到中成藥產(chǎn)品質(zhì)量。因此，需要對(duì)黃芩中藥材的有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制[4-5]。

用95%乙醇提取中化學(xué)成分是研究中草藥中活性物質(zhì)的主要提取方法，而水煎法是數(shù)千年來(lái)中藥材在臨床疾病治療時(shí)的主要用藥方式，95%乙醇提取物和水提取物中均含有治療疾病的活性化學(xué)物質(zhì)。因此，研制中藥材95%乙醇提取物及水提取物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并以黃芩素作為指標(biāo)成分定值，具有科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[6]。

筆者在本實(shí)驗(yàn)完成了黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素成分分析國(guó)家級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，確定了藥材、醇提物、水提物3種不同基質(zhì)中黃芩素成分含量的標(biāo)準(zhǔn)值與不確定度值[7]。黃芩及其提取物中黃芩素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，可為我國(guó)黃芩中藥材及中成藥研制和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供物質(zhì)基準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司，DAD檢測(cè)器，Agilent chemstation工作站；XS105型電子分析天平(Mettler公司，感量：0 g≤m≤5 g，0.01 mg；5 g

1.2國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)黃芩素 化學(xué)純標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，證書編號(hào)：GBW09516，純度標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度值(99.72±0.25)% (k=2)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)。

1.3中藥材及其提取物

1.3.1黃芩中藥材 產(chǎn)地河北省，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所馬林教授鑒定為正品，質(zhì)量檢查符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版規(guī)定要求[1]。黃芩中藥材經(jīng)除塵、粉碎、并過(guò)篩孔內(nèi)徑(250±9.9) μm(65目)篩，備用。精密稱取樣品1 g置棕色安瓿瓶密封包裝，共完成500支最小包裝1 g量的黃芩中藥材成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品的制備工作。

1.3.2黃芩95%乙醇提取物 取黃芩中藥材，粉碎后以5倍量95%乙醇作為提取溶劑，經(jīng)加熱回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮得浸膏，真空干燥，粉碎并過(guò)篩孔內(nèi)徑(250±9.9) μm(65目)篩，得棕紅色干粉，即為黃芩95%乙醇提取物，備用。精密稱取樣品100 mg，置棕色安瓿瓶密封包裝，共完成500支最小包裝100 mg量的黃芩95%乙醇提取物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品的制備工作。

1.3.3黃芩水提取物 取黃芩中藥材粉碎，加入6倍量純凈水，煎煮1 h，濾過(guò)，得提取液，將藥渣加入與提取液等體積的純凈水，煎煮1 h，濾過(guò)，再次向藥渣中加入與提取液等體積純凈水，繼續(xù)煎煮1 h，濾過(guò)。合并上述提取液，水浴揮干后，75 ℃真空干燥，得棕色粉末，即為黃芩水提取物，備用。精密稱取100 mg樣品置于棕色安瓿瓶密封包裝，共計(jì)完成了500支最小包裝100 mg量的黃芩水提取物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品的制備工作。

1.4試劑 甲醇(Fisher Chemical，色譜純)，磷酸(分析純，北京化學(xué)試劑公司)，娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1含量測(cè)定

2.1.1色譜條件 Agilent XDB C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 mm)；流動(dòng)相：甲醇：0.4%磷酸=51：49；梯度洗脫程序：0～17 min(51%甲醇)；17～25 min(51%→70%甲醇)；后運(yùn)行5 min；流速1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm。

2.1.2溶液的制備 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備方法：精密稱取黃芩素化學(xué)純標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5.09 mg(按化學(xué)純度99.72%計(jì))，置于50 mL量瓶，用色譜級(jí)甲醇將樣品完全溶解，并定容至刻度，搖勻，配制成黃芩素為101.52 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密移取0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL分別置于10 mL量瓶，用色譜級(jí)甲醇稀釋至刻度，獲黃芩素為1.0，5.1，10.2，20.3，50.8，101.5 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品提取方法：精密稱取黃芩中黃芩素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品100 mg、黃芩95%乙醇提取物中黃芩素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品30 mg、黃芩水提取物中黃芩素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品30 mg，分別置具塞錐形瓶，精密加95%乙醇：鹽酸=7：3混合溶液20 mL(95%乙醇提取物、水提取物為10 mL)，置90 ℃水浴中回流3 h，放冷，濾過(guò)，濾液置100 mL量瓶，用少量95%乙醇分次洗滌容器和殘?jiān)?，洗液濾入同一量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻。準(zhǔn)確量取1 mL，分別置10 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系考察 分別精密移取6種不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，注入液相色譜儀，按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件，記錄色譜圖及峰面積。色譜峰面積分別為38.68，198.35，389.67，802.44，1982.56，4003.11，以黃芩素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，獲得回歸方程為Y=39.424X-4.8638(r=1.0000，n=6)。標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩素標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.0～101.5 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取101.5 mg·L-1黃芩素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL至10 mL量瓶，用色譜純甲醇稀釋至刻度。采用高效液相色譜法，按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件，重復(fù)測(cè)定6次，記錄色譜圖，黃芩素峰面積分別為369.68，369.82，369.33，369.47，369.60，369.66，RSD為0.05%，表明儀器精密度良好。

準(zhǔn)確稱取自制黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5.09 mg(按化學(xué)純度99.72%計(jì))6份，置50 mL量瓶，用甲醇將樣品溶解，并定容至刻度，獲得101.52 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確吸取1.0 mL置10 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度。采用高效液相色譜法，按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件，各重復(fù)進(jìn)樣3次，分別記錄色譜圖，獲得黃芩素色譜面積均值/稱樣量為72.953，72.423，72.770，72.246，72.017，72.182，RSD為0.50%，表明實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。

2.2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別稱取黃芩中藥材、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物樣品各6份，按照“2.1.2”項(xiàng)樣品提取方法，按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。黃芩中黃芩素含量分別為8.084%，8.160%，8.162%，8.174%，8.005%，8.284%，平均8.145%，RSD 1.15%；黃芩95%乙醇提取物中黃芩素含量分別為4.333%，4.301%，4.342%，4.282%，4.284%，4.292%，平均4.306%，RSD為0.60%；黃芩水提取物中黃芩素含量分別為9.165%，9.122%，9.021%，9.070%，8.873%，9.026%，平均9.046%，RSD為1.12%。表明黃芩中藥材、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液制備方法重復(fù)性良好。

2.2.4回收率實(shí)驗(yàn) 分別稱取黃芩中藥材100 mg、黃芩95%乙醇提取物30 mg、黃芩水提取物樣品30 mg各6份，分別加入黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為加標(biāo)樣品。按照“2.1.2”項(xiàng)樣品提取方法制備樣品，采用HPLC法按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定黃芩素含量，計(jì)算回收率。黃芩中黃芩素回收率分別為100.50%，99.45%，98.64%，99.64%，99.77%，97.91%，平均回收率99.32%，RSD為0.92%；黃芩95%乙醇提取物中黃芩素回收率分別為100.89%，99.90%，98.79%，101.84%，98.34%，101.52%，平均回收率為100.21%，RSD為1.44%；黃芩水提取物中黃芩素的回收率分別為100.32%，99.47%，100.65%，101.63%，99.01%，99.02%，平均回收率100.02%，RSD為1.04%，結(jié)果表明方法回收率良好。

2.3均勻性實(shí)驗(yàn) 從500 支標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物中采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方法抽取15 瓶樣品，每瓶樣品平行取樣3 份，均按照“2.1.2”項(xiàng)樣品提取方法，按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定黃芩素含量，分別獲得45 個(gè)均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)。黃芩中藥材、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物的均勻性數(shù)據(jù)見表1。

采用單因素方差分析(One Way Anova)[8]對(duì)均勻性數(shù)據(jù)進(jìn)行組內(nèi)和組間統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)定黃芩中藥材、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素含量，F(xiàn)分別為1.24，1.21，1.29；均小于臨界值[F0.05(14，30)=2.04]，即，F(xiàn)

2.4長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將密封包裝后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品放置在常溫條件下長(zhǎng)期保存，考察樣品穩(wěn)定性，并分別于0，1，2，4，6，12 個(gè)月隨機(jī)抽樣，每個(gè)點(diǎn)隨機(jī)抽樣6 瓶，按照“2.1.2”項(xiàng)樣品提取方法，按照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定黃芩素含量，實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表2。以X代表時(shí)間(月)，以Y代表黃芩素含量值，分別擬合直線，獲得直線方程，計(jì)算斜率的不確定度[9-10]，結(jié)果分別為：

表1黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素成分含量均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

Tab.1ResultsofuniformitytestonbaicaleincontentinScutellariaBaicalensisandits95%alcoholextractandwaterextract

成分1abc2abc3abc4abc5abc黃芩8.2828.3788.3308.4558.2538.4548.2178.1978.3087.7868.4498.1818.3998.2898.431黃芩95%乙醇提取物4.3634.3994.2884.2894.3644.3584.3174.3544.3614.3534.3774.4144.3184.3134.298黃芩水提取物9.3359.0219.0779.0289.2369.1279.2819.3778.7849.2628.7488.8909.4618.7218.854成分6abc7abc8abc9abc10abc黃芩8.4448.4858.3588.4788.4058.2298.4568.2488.6228.3618.3888.4138.4628.4238.210黃芩95%乙醇提取物4.3154.3554.4544.3954.3974.4184.4204.4214.3674.3844.3384.4374.4764.4104.308黃芩水提取物8.8708.9498.8908.7599.0318.6278.5679.3059.0119.0708.9179.0519.0579.4809.137成分11abc12abc13abc14abc15abc黃芩8.5398.0528.4408.2568.5588.0998.4188.5217.9917.7027.8888.3308.2188.4008.394黃芩95%乙醇提取物4.3354.4944.4064.3824.3764.4014.4084.3914.3064.4064.3364.4174.4184.4054.424黃芩水提取物9.0799.0549.3719.6808.8889.8558.9099.44110.2289.3208.6848.5698.9709.0368.742

黃芩水提取物中黃芩素：Y=0.000 08X+0.0935

2.5黃芩素含量標(biāo)準(zhǔn)值定值 依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范[10]，采用6家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值方法對(duì)黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素成分進(jìn)行定值，定值數(shù)據(jù)見表3。采用格拉布斯檢驗(yàn)，剔除可疑值，并采用科克倫(Cochran)等精度檢驗(yàn)，證明黃芩素成分含量的測(cè)量數(shù)據(jù)均屬等精度數(shù)據(jù)。計(jì)算獲得6家聯(lián)合定值的黃芩中黃芩素成分含量標(biāo)準(zhǔn)值P=7.952%，S=0.001 631；黃芩95%乙醇提取物中黃芩素成分含量標(biāo)準(zhǔn)值P=4.285%，S=0.000 408；黃芩水提取物中黃芩素成分含量標(biāo)準(zhǔn)值P=8.800%，S=0.002 375。

2.6不確定度評(píng)定

2.6.1成分含量標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度評(píng)估 黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總不確定度由3個(gè)部分組成：測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)值引入的不確定度、樣品不均勻性引入的不確定度、樣品穩(wěn)定性引入的不確定度。其中，測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)值引入的不確定度包含國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度、中藥材及其提取物中有效成分提取及含量測(cè)定過(guò)程引入的不確定度以及聯(lián)合定值的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度等。

2.6.2標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度計(jì)算 ①黃芩素一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度值u(P)。黃芩素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值為(99.72±0.25)%，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度值為0.25%/2=0.125%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度值為u(P)=0.125%/99.72% =0.00125。②測(cè)量數(shù)據(jù)的不確定度值u(f)。利用測(cè)量數(shù)據(jù)計(jì)算：

表2黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素成分含量長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果

Tab.2Resultsoflong-termstabilitytestonbaicaleincontentinScutellariaBaicalensisandits95%alcoholextractandwaterextract

%

表3 黃芩、黃芩 95% 乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素含量的聯(lián)合定值

③聯(lián)合定值的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度值urel。按照文獻(xiàn)[11]規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算公式為：

S(y)：標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差；q：黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物溶液的測(cè)定次數(shù)；n：標(biāo)準(zhǔn)溶液的個(gè)數(shù)×每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)；C0：標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mg·mL-1)；C1：中藥材黃芩、95%乙醇提取物、水提取物溶液的濃度(mg·mL-1)；i：第n個(gè)校準(zhǔn)溶液的第n次測(cè)量。以x代表檢測(cè)樣品的溶液濃度，以y代表檢測(cè)樣品的吸光度，分別擬合獲得直線聯(lián)合標(biāo)定單位的標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)不確定度urel值，結(jié)果見表4。

比較6家單位獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度值，取最大值分別為：黃芩中黃芩素成分含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度urel=0.005 158，黃芩95%乙醇提取物中黃芩素成分含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度urel=0.003 147，黃芩水提取物中黃芩素成分含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度urel=0.014 94。

表4聯(lián)合定值標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對(duì)不確定度

Tab.4Relativeuncertaintyintroducedbystandardcurve

序號(hào)黃芩黃芩95%乙醇提取物黃芩水提取物10.002 1420.001 2860.006 40020.005 1580.003 1470.014 9430.004 7930.002 8970.014 1340.003 1790.002 0120.009 97550.003 8970.002 4790.011 8960.003 8120.002 3080.011 29

④合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算，按照Uc(x)=

2.6.6擴(kuò)展不確定度 由總合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算擴(kuò)展不確定度(U)，擴(kuò)展因子k=2，黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴(kuò)展不確定度分別為0.222%，0.117%，0.398%。

2.7成分含量標(biāo)準(zhǔn)值及不確定度表示 在測(cè)量不確定度的最終計(jì)算中，一般采用只進(jìn)不舍的規(guī)則。故黃芩中黃芩素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為(7.95±0.23)%，k=2；黃芩95%乙醇提取物中黃芩素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為(4.29±0.12)%，k=2；黃芩水提取物中黃芩素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為(8.80±0.40)%，k=2。

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用單一化學(xué)成分標(biāo)識(shí)復(fù)雜成分體系的量值傳遞技術(shù)路線，采用高效液相色譜法-多家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定的方法，成功研制了黃芩中黃芩素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)090438、黃芩95%乙醇提取物中黃芩素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)090447、黃芩水提取物中黃芩素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)090453，解決了中藥材及其提取物等復(fù)雜體系中的相關(guān)化學(xué)成分的量值溯源性科學(xué)技術(shù)難題，為中藥相同類型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制起到了指導(dǎo)和示范作用。

筆者在本實(shí)驗(yàn)研制的黃芩及其提取物中黃芩素成分分析系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均含有準(zhǔn)確的量值與不確定度，屬國(guó)家二級(jí)計(jì)量有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具量值溯源和量值傳遞功能，在國(guó)內(nèi)外均屬首次研制，填補(bǔ)了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)領(lǐng)域的品種空白。同時(shí)為提高我國(guó)中藥材及中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、推動(dòng)中藥的標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化提供了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)方法。