易南星，王曉赟，梁倩倩，王擁軍，韓?；?，王藝儒，馬迎輝，施 杞，，4，張 霆，，徐 浩＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所 上海 200032；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬光華醫(yī)院 上海 200052；4.教育部重點實驗室（筋骨理論與治法）上海 200032）

膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是一種慢性進行性關(guān)節(jié)疾病，病變主要累及患病關(guān)節(jié)的軟骨、軟骨下骨、滑膜等，主要病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨贅形成、滑膜炎癥和關(guān)節(jié)間隙變窄等[1]。該病發(fā)病率高，影響著約2.5億人口，全球大于65歲的人將近一半受此病的影響，且女性多于男性[2,3]。到目前為止,晚期KOA 患者除進行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)外尚缺乏有效的治療手段，給患者家庭及社會造成了巨大的負(fù)擔(dān)[4]。因此尋找新的KOA治療靶點和方法具有重要意義。

淋巴系統(tǒng)主要的生理功能是維持機體的體液平衡、免疫監(jiān)視和胃腸道脂肪酸的吸收，與微循環(huán)之間關(guān)系密切[5]。近年來，越來越多的研究證實淋巴回流功能在炎癥性關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用：①腫瘤壞死因子-轉(zhuǎn)基因（Tumor Necrosis Factor-Transgenic，TNF-Tg）和K/B×N 等慢性炎癥性-侵蝕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型出現(xiàn)淋巴回流功能下降[6]；②VEGFR-3中和性抗體特異性抑制淋巴管生成，減少淋巴回流，會加重TNF-Tg 小鼠關(guān)節(jié)炎癥損傷[7]；③在關(guān)節(jié)局部過表達VEGF-C，促進回流，顯著減輕關(guān)節(jié)炎癥損傷[8]。

中醫(yī)學(xué)把KOA 歸屬于“痹癥”、“頑痹”等病證范疇,以肝腎氣血虧虛、風(fēng)寒濕邪氣外襲、痰瘀互結(jié)、痹阻經(jīng)絡(luò)為主要病因病機[9]。痹病“不通則痛”的特點與淋巴管回流功能障礙加重關(guān)節(jié)炎癥的病理表現(xiàn)極為類似。具有“止痹痛”作用的中藥通過促進淋巴回流，起到治療“痹病”的作用。如中藥復(fù)方獨活寄生湯可以改善淋巴回流功能，促進淋巴管生成，減輕關(guān)節(jié)炎癥[10]。中藥有效組分阿魏酸抑制腫瘤壞死因子α刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮，減輕一氧化氮對淋巴管平滑肌細(xì)胞的損傷，改善慢性炎癥下的淋巴回流功能，從而減輕關(guān)節(jié)炎癥[11]。三七總皂苷可以刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生VEGF-C 促進淋巴管生成[12]。本研究將首次從淋巴管角度探討JBT 對KOA 模型小鼠淋巴管回流功能及疾病進程的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

10 周齡C57BL 雄性小鼠120 只，體重26 ± 2 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。所有小鼠按體重的大小隨機分為3 組：JBT 組、Mobic 組和PBS 組。各組小鼠在相同條件下自由飲水、攝食，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供全價顆粒飼料。本研究所有實驗均符合上海中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會規(guī)定。

1.2 試劑、儀器

異氟烷（沃瑞德，Batch NO.217140901），脫毛膏（利潔時公司，印度），吲哚菁綠（Acorn），乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，10009617），伊紅（Sigma：E4009-5G），蘇木素精（sigma，H-3136），艾爾新藍(lán)（sigma，A5268），酸性橙（Sigma，1936-15-8），PBS（Medicago，09-2052-100）。小動物麻醉機（Matrx VMR，美國），近紅外成像系 統(tǒng)（Olympus，MVX10），全片掃描儀（Olympus，VS120-SL）。

2 方法

2.1 藥物及給藥

蠲痹湯藥物組成：羌活3 g、獨活3 g、秦艽3 g、當(dāng)歸9 g、川芎2.1 g、甘草1.5 g、海風(fēng)藤6 g、桑枝9 g、乳香2.4 g、木香2.4 g、桂心（后下）1.5 g。所有中藥均購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房。根據(jù)《實驗動物藥理學(xué)》，將小鼠（20 g）與人（70 kg）的中藥劑量進行換算（換算系數(shù)9.01），小鼠需服中藥煎劑濃度為0.52 g·mL-1，取上述中藥10 付，加12 倍水，浸泡30 min，煮沸后繼續(xù)煎煮30 min，趁熱過濾得煎液1；所余藥渣加8 倍水，同樣方法得煎液2；合并2 次煎液，通風(fēng)櫥中加熱濃縮至770 mL，分裝后-80℃保存。JBT 組：小鼠按10 mL/kg/d) 隔日灌胃給藥，每次約0.2 mL；Mobic 組：莫比可片7.5 mg，加純水溶解，灌胃濃度0.022 5 mg·mL-1，隔日灌胃0.2 mL；PBS 組：等體積的PBS 灌胃，隔日灌胃，連續(xù)灌胃16周。

2.2 造模方法

所有小鼠右膝均接受DMM 手術(shù)以誘導(dǎo)KOA 模型，左膝接受假手術(shù)作為對照。具體方法如下：腹腔注射氯胺酮麻醉小鼠（20 mg·kg-1），碘伏酒精消毒小鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)部位。OA 組：手術(shù)刀片在右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)髕韌帶與內(nèi)側(cè)副韌帶中間開0.5 cm 切口，顯微鏡下牽開皮膚及脂肪組織，暴露內(nèi)側(cè)半月板、內(nèi)側(cè)半月板脛骨韌帶，用顯微手術(shù)剪貼著脛骨切斷內(nèi)側(cè)半月板脛骨韌帶，縫合皮膚切口；Sham 組：左膝關(guān)節(jié)相同位置開0.5 cm 切口，縫合皮膚切口。術(shù)后切口處涂些許新霉素眼膏，放回籠內(nèi)，等待小鼠蘇醒。

2.3 淋巴管回流功能檢測

將小鼠置于麻醉機中，異氟烷麻醉后，雙下肢脫毛，注意保護小鼠皮膚，將小鼠置于熱臺上，熱臺溫度保持在28℃，給予小鼠面罩氣體麻醉。用微量注射器，30G 針頭，吸取10 uL 0.1 g·mL-1濃度的ICG，注射于小鼠膝關(guān)節(jié)腔。注射后3 h 拍攝膝關(guān)節(jié)照片，注射后6 h 后再次拍攝膝關(guān)節(jié)照片，在腘窩淋巴結(jié)區(qū)域圈定合適區(qū)域（Region of Interest，ROI），檢測信號亮度。利用軟件Image J 對ROI區(qū)域分析，得到數(shù)據(jù)代入固定公式進行計算【clearance=(ROI3h-ROI3hbg)-(ROI6h-ROI6hbg)/(ROI3h-ROI3hbg)，bg：background】，得到的結(jié)果是小鼠膝關(guān)節(jié)ICG清除率，其代表淋巴回流功能。

圖1 各組小鼠膝關(guān)節(jié)ICG的清除情況及結(jié)果

2.4 膝關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)檢測

淋巴管回流功能檢測結(jié)束后，小鼠脫頸處死并取膝關(guān)節(jié)，標(biāo)本在10%福爾馬林固定24 h 后，10%EDTA脫鈣4 周，每72 h 更換脫鈣液1 次，組織脫水，石臘包埋，4 um 矢狀位連續(xù)切片，進行ABHO 染色及免疫組化染色。Olympus圖像采集系統(tǒng)采片。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進行描述，應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析（oneway ANOVA），行LSD 檢驗。P＜0.05 表示有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 蠲痹湯對小鼠膝關(guān)節(jié)淋巴管回流功能的影響

ICG 是一種帶負(fù)電，具有水溶性的三碳菁染料，ICG 的激發(fā)光波長大概是780 nm，吸收光譜波長峰值800-830 nm，這段波長可以被近紅外光譜儀檢測。注射入皮下后，迅速與組織液中的白蛋白結(jié)合為大分子，從而被淋巴管吸收，因此用于淋巴管回流功能的檢測。在小鼠膝關(guān)節(jié)部注射ICG，然后利用近紅外儀器分別在注射后3 h 和6 h 檢測，與ICG 注射后3 h 相比，ICG 注射6 h 后，膝關(guān)節(jié)ROI 區(qū)域的信號強度均有減弱，PBS 組的信號減弱更慢。與PBS、Mobic 組比較，JBT 組在術(shù)后4 周和8 周小鼠膝關(guān)節(jié)的ICG 清除率均有顯著改善（P＜0.05）（圖1）。

3.2 各組小鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨ABHO 染色及OARSI評分

ABHO 染色顯示，矢狀面上，SHAM 組小鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面覆蓋一層藍(lán)染的軟骨，軟骨表面連續(xù)，模型組小鼠股骨與距骨表面的軟骨遭到了破壞，藍(lán)染區(qū)域表面不完整不連續(xù)，區(qū)域面積減少，蠲痹湯治療后，軟骨結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，藍(lán)染區(qū)域面積在前兩個時間點優(yōu)于PBS 組和Mobic 組。隨著時間的推移，軟骨的面積逐漸減少，術(shù)后16周時，關(guān)節(jié)軟骨基本完全被磨損，組間已無明顯差異。OARSI 評分中，在術(shù)后4 周和8 周，與PBS、Mobic 組比較，JBT 組關(guān)節(jié)軟骨的評分明顯改善（P＜0.05），在12周和16周，發(fā)現(xiàn)3組之間沒有明顯差異（圖2）。

3.3 蠲痹湯對小鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨II 型膠原含量的影響

II 型膠原免疫組織化學(xué)染色顯示，矢狀面上，SHAM 組小鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面覆蓋一層灰色的軟骨，軟骨表面連續(xù)，模型組小鼠股骨與距骨表面的軟骨遭到了破壞，灰染區(qū)域表面不完整不連續(xù)，區(qū)域面積減少，蠲痹湯治療后，軟骨結(jié)構(gòu)磨損的進程減慢，灰染區(qū)域面積優(yōu)于PBS組和Mobic組（圖3）。

3.4 蠲痹湯對小鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨Nitege的影響

Nitege 膠原免疫組織化學(xué)染色顯示，矢狀面上，SHAM 組小鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面覆蓋一層完整的軟骨，軟骨表面連續(xù)，模型組小鼠股骨與距骨表面的軟骨遭到了破壞，關(guān)節(jié)周圍組織中出現(xiàn)了陽性染色，蠲痹湯治療后，與PBS組比較，關(guān)節(jié)軟骨中Nitege 含量增加的速度減慢（圖4）。

4 討論

圖2 各組小鼠膝關(guān)節(jié)ABHO染色及OARSI評分

圖3 各組小鼠膝關(guān)節(jié)II型膠原免疫組化染色

本研究首次從關(guān)節(jié)淋巴管回流功能障礙、淋巴回流不暢角度，探討膝骨關(guān)節(jié)炎“風(fēng)寒濕侵襲，痹阻不通”病機，及蠲痹湯“祛風(fēng)除濕、蠲痹止痛”功效的科學(xué)內(nèi)涵。研究結(jié)果表明，蠲痹湯能夠改善KOA 模型小鼠膝關(guān)節(jié)淋巴管功能、促進淋巴回流、延緩關(guān)節(jié)軟骨退變進程、起到治療作用。淋巴管是該方治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用靶點之一。

我們的前期研究表明，小鼠膝關(guān)節(jié)周圍存在淋巴管網(wǎng)系統(tǒng)，而且淋巴管的回流功能在炎癥性關(guān)節(jié)炎疾病的進程中起著重要的作用[13]。通過抑制慢性炎癥動物模型TNF-α轉(zhuǎn)基因模型小鼠淋巴管的回流功能，會加重關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度[14]。而通過按摩促進淋巴管的回流功能會改善全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)（total knee arthroplasty，TKA）患者術(shù)后病情的恢復(fù)[15]。其機制可能是TNF-α引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞炎性活化，造成炎癥因子和炎性細(xì)胞的大量釋放，抑制了淋巴管平滑肌細(xì)胞的增殖，造成淋巴管平滑肌細(xì)胞收縮能力下降[16]。而通過手法按摩促進了淋巴管的回流功能。淋巴系統(tǒng)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、銀霄病等疾病過程中扮演重要角色[17]，而淋巴管回流功能障礙加重炎癥性疾病與中醫(yī)“痹證”中“痹阻不通、不通則痛”的發(fā)病機理極為類似[18]。因此，深入研究淋巴管的功能有利于從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度對痹證理論進行探討。

圖4 各組小鼠膝關(guān)節(jié)Nitege免疫組化染色

蠲痹湯治療痹證由來已久，《楊氏家藏方》卷四：蠲痹湯主治風(fēng)溫相搏，身體煩疼，項臂痛重，舉動艱難，及手足冷痹，腰腿沉重，筋脈無力?！吨赜唶?yán)氏濟生方》中蠲痹湯主治身體煩疼，項背拘急，或痛或重，舉動艱難，及手足冷痹，腰腿沉重，筋脈無力。《魏氏家藏方》卷八：氣弱當(dāng)風(fēng)飲吸，風(fēng)邪容于外，飲濕停于內(nèi)，風(fēng)濕內(nèi)外相搏，體倦舌麻，甚則惡風(fēng)多汗，頭目昏眩，遍身不仁?！夺t(yī)學(xué)心悟》卷三：風(fēng)寒濕三氣合而成痹，蠲痹湯主之。《金鑒》卷三十九：蠲痹湯主治痹病而身寒無熱，四肢厥冷。上述蠲痹湯雖治療主證各有差異，但不外乎風(fēng)寒濕三邪侵襲人體，造成人體關(guān)節(jié)經(jīng)絡(luò)痹阻不通，瘀而成痹。因此，蠲痹湯是治療痹證的主方之一。

現(xiàn)代研究表明，蠲痹湯含藥血清能夠顯著降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠外周血中單核細(xì)胞腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的表達水平[19]，也可以升高對效應(yīng)性T細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子分泌具有抑制作用的IL-35 水平，從而改善局部的炎癥情況[20]。其內(nèi)服外洗用法可顯著降低關(guān)節(jié)炎患者血清和關(guān)節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的水平而升高金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的水平[21]。蠲痹湯中單體成分阿魏酸可抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達，阻斷NO 的產(chǎn)生，從而阻止淋巴管回流功能的下降[22]。有研究表明，蠲痹湯凍干粉可抑制TNF-α誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO，減輕其對淋巴管平滑肌細(xì)胞的損傷，保證淋巴管對炎癥因子的回流功能，達到治療關(guān)節(jié)炎癥的目的。

綜上所述，蠲痹湯可通過增強早期KOA 模型小鼠膝關(guān)節(jié)淋巴管回流功能，減輕炎癥因子和炎癥細(xì)胞在局部的淤積；延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變速度，從而起到治療KOA 的作用。但是膝骨關(guān)節(jié)炎病因復(fù)雜，尤其是在疾病后期，蠲痹湯對淋巴管回流功能的改善遠(yuǎn)不能達到治愈KOA 的目的，如何明確該方的臨床應(yīng)用證型,是否需要其他方藥合理配伍，加減化裁，解決臨床多靶點問題，有待于深入研究。