周艷艷，付佳琳，雷 震

（1.河南省中醫(yī)院 鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 鄭州 450046；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 鄭州 450046）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是育齡婦女的常見(jiàn)病，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明確[1-3]。近年來(lái)眾多研究發(fā)現(xiàn)[4-6]，由于各種因素導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜相關(guān)凋亡基因表達(dá)異常，使內(nèi)膜細(xì)胞在異位部位的生長(zhǎng)能力增強(qiáng)，最終導(dǎo)致異位的內(nèi)膜發(fā)展為EMs。細(xì)胞凋亡與EMs 發(fā)病密切相關(guān)，研究細(xì)胞凋亡在EMs 中的作用機(jī)制有著重要的意義。內(nèi)異方由筆者根據(jù)尤昭玲教授經(jīng)驗(yàn)方內(nèi)異方[7]結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)化裁而來(lái)，在臨床治療EMs 取得了較好的臨床療效，但作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在通過(guò)實(shí)驗(yàn)，觀察內(nèi)異方對(duì)EMs 大鼠細(xì)胞增殖與凋亡的影響，基于化瘀解毒理論，探討內(nèi)異方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的作用機(jī)制，為臨床對(duì)本病的治療提供思路與方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

兔抗大鼠NF-kB（B1101）、HIF-1α（B3301）抗體：武漢博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠Caspase-3（197677-1-AP）、Bax（50599-2-1g）、Bcl-2（196841）抗體、小鼠抗大鼠B-actin（60008-1-1g）抗體、羊抗小鼠IgG 抗體（SA00001-2）、羊抗兔IgG 抗體（SA00001-1）：武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

其他：微量BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（23235），上海恒斐生物科技有限公司；MaxiLumin-WB 飛克級(jí)化學(xué)發(fā)光底物（20170112），北京索萊寶科技有限公司；蛋白電泳凝膠制備試劑盒（JC-PE022）、RIPA 裂解液（20170407），北京百智生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

凝膠成像儀（Chemi Doc XRS+System，美國(guó)Bio-RAD 公司），電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（DY89-Ⅱ，寧波新芝生物科技股份有限公司），酶標(biāo)儀（Spectra Max M2，美國(guó)Molecular Devices 公司）,賽多利斯電子精密天平（BT25S，德國(guó)賽多利斯公司），高速冷凍離心機(jī)（JW-3022HR，安徽嘉文儀器裝備有限公司）。

1.2 藥物

內(nèi)異方的組成是土茯苓、土鱉蟲、土貝母、鬼箭羽、大血藤、連翹、香附、黃芪、烏藥（藥物應(yīng)用三九免煎中藥顆粒，批號(hào)：1701001W）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇同種未孕成年雌性8-10 周齡SD 大鼠120只，SPF 級(jí)，體重200-250 g。購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：No.41003100004372。采用IVC 獨(dú)立通風(fēng)方式飼養(yǎng)觀察。喂食SPF 飼料，由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常規(guī)飼養(yǎng)。

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后連續(xù)2 周每日定時(shí)進(jìn)行陰道細(xì)胞學(xué)涂片檢查，選擇動(dòng)情周期4-5 d，并連續(xù)有2 個(gè)或以上正常動(dòng)情周期的大鼠造模。

1.4 病癥結(jié)合EMs動(dòng)物模型的建立

采用手術(shù)復(fù)制[8]結(jié)合人工干預(yù)法[9]建立EMs 瘀毒證模型：術(shù)后1周，待大鼠腹部切口基本愈合后進(jìn)行以下干預(yù)：①用貼有紗布的止血鉗夾鼠尾，使之保持激怒爭(zhēng)斗狀態(tài)，2 min·次-1，每周1 次；②用繃帶細(xì)條束縛大鼠后肢，使之行走困難，30 min·次-1，每周1 次；③食用油1 mL/100 g 灌胃，每周1 次；④1g/L 腎上腺素皮下注射，0.2 mL·只-1，每周1 次。以上方法在1 周內(nèi)隨機(jī)交替進(jìn)行。連續(xù)3周后剖腹探查異位內(nèi)膜生長(zhǎng)情況。

1.5 分組及給藥方法

將造模成功的108 只大鼠隨機(jī)分為6 組：模型組、常氧內(nèi)異方低劑量組（常中低組）、缺氧內(nèi)異方低劑量組（缺中低組）、常氧內(nèi)異方高劑量組（常中高組）、缺氧內(nèi)異方高劑量組（缺中高組）、散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組，每組18只。

給藥方法：模型組灌服0.9%生理鹽水、常中低組與缺中低組每日灌服內(nèi)異方（10 g·kg-1，灌胃量為成人臨床劑量的6.3 倍）、常中高組與缺中高組每日灌服內(nèi)異方（20 g·kg-1）、散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組（0.5 g·kg-1）。以上各組大鼠每日1次，每次灌胃給藥容積10 mL·kg-1，共28 d。

缺氧狀態(tài)制作：將缺中低組、缺中高組大鼠IVC籠中注入混合氣體（95%N2加5%CO2混合氣體），每天灌注30-60 min。治療過(guò)程中缺中低組死亡2只，缺中高組死亡3只。

1.6 用藥過(guò)程中各組大鼠行為學(xué)觀察

觀察大鼠體重、飲食及飲水情況，眼結(jié)膜血管充血、耳廓唇周、爪甲尾部及舌質(zhì)顏色情況，并觀察其精神體征、反應(yīng)情況。

1.7 異位內(nèi)膜組織形態(tài)及病理學(xué)觀察

在末次給藥后第1 d 剖腹手術(shù)，取出異位內(nèi)膜，剝離周圍的脂肪肌肉組織，按照各組組別擺放。觀察異位病灶大小、沿腹壁生長(zhǎng)、與周圍組織粘連情況、積液形態(tài)、病灶內(nèi)血管情況等，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量異位內(nèi)膜的大小，記錄各組間的差異。HE 染色進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.8 蛋白印跡法檢測(cè)NF-kB、HIF-1α、Caspase-3、Bax、Bcl-2

在末次給藥第1 d 剖腹手術(shù)，冰上取各組異位內(nèi)膜，稱重后-80℃保存?zhèn)溆?。蛋白樣片?yán)格按照蛋白印跡檢測(cè)法步驟操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，其中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 內(nèi)異方對(duì)大鼠一般狀態(tài)的影響

模型組、缺氧組大鼠易激惹、煩躁，不易抓取，同籠中大鼠互相撕咬、打斗，缺氧組表現(xiàn)更明顯。模型組隨天數(shù)增加，上述外在變化繼續(xù)加劇，3周后大鼠消瘦、毛發(fā)稀疏；缺氧組大鼠隨灌胃給藥天數(shù)的增加，上述癥狀稍有緩解。給予內(nèi)異方兩組常氧組大鼠隨著灌胃給藥天數(shù)的增加，上述癥狀緩解。散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組大鼠易激惹、煩躁、口渴、表情痛苦等外在表現(xiàn)隨著灌胃給藥天數(shù)增加無(wú)明顯變化，隨著灌藥天數(shù)增加，體重增加緩慢、毛發(fā)稀疏、無(wú)光澤。

圖1 大鼠異位內(nèi)膜體積變化比較

2.2 內(nèi)異方對(duì)大鼠異位內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)的影響

模型組大鼠異位病灶較前增大，沿腹壁蔓延生長(zhǎng)，可見(jiàn)病灶局部及盆腔粘連帶，積液光亮、形態(tài)飽滿，呈圓形或橢圓形囊泡，內(nèi)有透明或半透明囊液，部分為粘稠不透明液體，可見(jiàn)血管形成。常中高組及常中低組大鼠異位病灶較前明顯縮小，形態(tài)欠飽滿，血管減少，前者病灶局部及盆腔粘連較后者明顯減輕。缺氧中藥兩組組大鼠異位病灶大小改善略差于常氧中藥組，局部及盆腔仍粘連，但病灶形態(tài)欠飽滿，未見(jiàn)沿腹壁蔓延生長(zhǎng)。與模型組相比，常中高組異位內(nèi)膜體積縮小最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）。

2.3 內(nèi)異方對(duì)大鼠異位內(nèi)膜病理結(jié)構(gòu)的影響

模型組異位內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，呈子宮腔狀或環(huán)形封閉式結(jié)構(gòu)，內(nèi)有囊腫形成。上皮為立方狀或柱狀上皮，大部分上皮細(xì)胞有分泌現(xiàn)象，間質(zhì)致密，血管增生密集，并可見(jiàn)到少量腺體及炎細(xì)胞浸潤(rùn)；常氧中藥兩組異位內(nèi)膜上皮層明顯變薄，細(xì)胞低平，呈扁平狀，甚至萎縮呈線狀排列，細(xì)胞排列疏松，內(nèi)膜脫落，間質(zhì)細(xì)胞減少、小而稀疏，血管明顯減少，未見(jiàn)明顯增生及假腺體改變，縱切面異位內(nèi)膜呈縫隙狀、腺體萎縮，有纖維化傾向，且常中高組較常中低組表現(xiàn)更明顯；散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組內(nèi)膜上皮層變薄，細(xì)胞低平，呈扁平狀，細(xì)胞疏松，甚至萎縮呈線狀排列，內(nèi)膜脫落，間質(zhì)細(xì)胞減少，血管減少（圖2）。

2.4 內(nèi)異方對(duì)HIF-1α、NF-kB、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

圖2 組織切片HE染色（×200倍）

與模型組相比，常中高組大鼠異位內(nèi)膜中Hif-1α降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3-B）；與模型組相比，常中低組、散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組Ems 大鼠NF-kB降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），常中高組顯著降低（P＜0.01）（圖3-C）；與模型組相比，其他各組Ems大鼠異位內(nèi)膜中Caspase-3 水平均升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3-D）；與模型組相比，常氧內(nèi)異方組、缺氧內(nèi)異方組及散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊組異位內(nèi)膜中Bax/Bcl-2 水平均升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3-E）。

3 討論

圖3 治療后各組大鼠異位內(nèi)膜的蛋白表達(dá)比較

子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）臨床表現(xiàn)多樣，主要包括痛經(jīng)、盆腔包塊、不孕和性交痛等，嚴(yán)重影響婦女的身心健康和生活質(zhì)量，成為婦科臨床的現(xiàn)代病、多發(fā)病和疑難病。該病在中醫(yī)學(xué)屬“月經(jīng)不調(diào)”、“癥瘕”、“痛經(jīng)”等范疇[10-12]，歷代醫(yī)家對(duì)其病因病機(jī)進(jìn)行了探索，認(rèn)為其病機(jī)較為復(fù)雜,但多與血瘀相關(guān)[13-15]，臨床治療應(yīng)辨證論治。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)本病發(fā)病學(xué)說(shuō)眾多，如：經(jīng)血逆流、體腔上皮化生學(xué)說(shuō)及淋巴和靜脈播散、在位內(nèi)膜決定論、醫(yī)源性散播、內(nèi)分泌、遺傳因素、免疫因素等[16-19]，但每種學(xué)說(shuō)并不能完全解釋該病在實(shí)驗(yàn)及臨床中的相關(guān)表現(xiàn)。迄今為止，確切的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，近年來(lái)細(xì)胞的增殖與凋亡失衡學(xué)說(shuō)是人們研究的熱點(diǎn)[20,21]。

核轉(zhuǎn)錄因子-kB（NF-kB）在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)中起作用，是凋亡反應(yīng)關(guān)鍵的調(diào)控因子，能上調(diào)多種基因和細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖,阻止細(xì)胞凋亡而誘發(fā)EMs。了解NF-kB 在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用，有助于闡明子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步為子宮內(nèi)膜異位癥的治療提供新思路。本研究結(jié)果提示NF-kB 在模型組異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞中呈高表達(dá)提示EMs 發(fā)病可能與NF-kB 的過(guò)度激活有關(guān)；灌胃給予內(nèi)異方的各組大鼠異位內(nèi)膜中NF-kB 水平明顯低于模型組，提示內(nèi)異方能抑制其過(guò)度表達(dá)。

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）被稱為“死亡蛋白酸”,是哺乳動(dòng)物細(xì)胞調(diào)亡的關(guān)鍵蛋白酶，它一旦被激活，即發(fā)生下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使凋亡不可避免[22]。Bax、Bcl-2 是目前發(fā)現(xiàn)在線粒體凋亡通路中起重要調(diào)節(jié)作用的基因之一[23]。研究表明[24]，Bcl-2 與Bax 之間的比例是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，當(dāng)Bcl-2 蛋白過(guò)多時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bax 蛋白過(guò)多時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有關(guān)Caspase-3、Bax/Bcl-2在子宮內(nèi)膜異位癥的異常表達(dá)已多方證實(shí)。本課題研究結(jié)果提示中藥各組大鼠異位內(nèi)膜中Caspase-3、Bax/Bcl-2 水平明顯高于模型組。提示內(nèi)異方可能通過(guò)增強(qiáng)Caspase-3、Bax/Bcl-2 表達(dá)，促進(jìn)異位細(xì)胞凋亡來(lái)阻斷異位內(nèi)膜的增殖。

子宮內(nèi)膜異位癥種植學(xué)說(shuō)指出，經(jīng)期子宮內(nèi)膜的螺旋小動(dòng)脈收縮，使內(nèi)膜處于缺氧的狀態(tài)[25]，內(nèi)膜碎片進(jìn)入腹腔后缺氧繼續(xù)存在，而適度的缺氧可減少內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡，有利于細(xì)胞的異位種植[26]。細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）的穩(wěn)定表達(dá)有利于提高異位內(nèi)膜的種植能力，促進(jìn)新生血管的形成[27]。說(shuō)明HIF-1α在EMs 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本課題結(jié)果顯示，常氧中藥兩組HIF-1α水平明顯低于缺氧組。提示缺氧為異位子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)的重要條件，內(nèi)異方通過(guò)下調(diào)HIF-1α水平改善子宮內(nèi)膜異位癥表現(xiàn)。

子宮內(nèi)膜異位癥病變廣泛、形態(tài)多樣，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，異位內(nèi)膜周期性出血所形成的結(jié)節(jié)、包塊等，祖國(guó)醫(yī)學(xué)稱之為“離經(jīng)之血”，離經(jīng)之血蓄積于下焦，血聚為瘀、瘀聚為癥瘕。近年來(lái)雖然各醫(yī)家對(duì)該病的病因病機(jī)認(rèn)識(shí)不盡相同，但大都是以血瘀立論。即“瘀血”是產(chǎn)生子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)鍵?！鹅`樞·五音五味篇》云：“婦人之生，有余于氣，不足于血，以其數(shù)脫血也”，這種有余于氣的狀態(tài)易引起肝失疏泄，肝郁氣滯，氣滯則血瘀。《景岳全書·婦人規(guī)》云：“瘀血留滯作，唯婦人有之。其證則或由經(jīng)期，或由產(chǎn)后，凡內(nèi)傷生冷，或外受風(fēng)寒，或恚怒傷肝，氣逆而血留…或積勞積弱，氣弱而不行，總由血?jiǎng)又畷r(shí)，余血未凈而一有所逆，則留滯日積而漸成癥矣?！笨傊畠?nèi)因外邪皆可導(dǎo)致瘀血內(nèi)阻，瘀血既成，阻于胞脈胞絡(luò)，下焦氣化不利，水液代謝失調(diào)，日久生濕化濁，聚而化熱蘊(yùn)毒，表現(xiàn)為“瘀毒互結(jié)”的基本病機(jī)；另一方面，毒熱內(nèi)蘊(yùn)，進(jìn)一步煎熬營(yíng)血，血運(yùn)遲緩，加重瘀血，毒瘀凝結(jié)，導(dǎo)致疾病纏綿難愈。故本病病機(jī)是瘀毒互結(jié)，病位在肝，病在血分。

內(nèi)異方由土茯苓、土鱉蟲、土貝母、鬼箭羽、大血藤、連翹、香附、黃芪、烏藥組成。方中土茯苓：甘淡平，歸肝胃經(jīng)，有解毒清熱，除濕通絡(luò)之功效，《本草正義》言：“土茯苓，利濕去熱，能入絡(luò)，搜濕熱之蘊(yùn)毒。”；土鱉蟲咸寒，歸肝經(jīng)，具有活血化瘀，通經(jīng)止痛之功效，臨床常用于瘀血經(jīng)閉及癥瘕痛塊；以上二味化瘀活血，解毒通絡(luò)共為君藥。土貝母性微寒味苦，歸肺脾經(jīng)，入肺則制約肝之妄動(dòng)，入脾則減弱肝之克制，功在散結(jié)解毒；鬼箭羽又名見(jiàn)腫消，性辛味苦寒，歸肝經(jīng)，辛能行，苦寒解毒，有破血通絡(luò)、解毒消腫之功效；大血藤微苦微寒，歸肝膽肺經(jīng)，能散瘀止痛，清熱消腫；連翹性微寒味苦，入心、肝、膽經(jīng)，有清熱解毒，散結(jié)消腫作用。以上四者助君藥加強(qiáng)化瘀散結(jié)、清熱解毒之力共為臣藥。香附辛微苦甘，平。入肝、三焦經(jīng)。有理氣解郁，止痛調(diào)經(jīng)功效，辛能散，微苦能降，微甘能和，為血中氣藥，一則行氣以助瘀化，二則用在味苦藥中防其凝滯；炙黃芪甘，溫。歸肺、脾經(jīng)。具有健脾益氣功效，能提高減弱之免疫力，方中更加入辛溫之烏藥既防諸藥苦寒凝滯氣血，又能止痛減輕癥狀共為佐使之藥。綜觀全方補(bǔ)瀉兼施、寒熱并用，標(biāo)本兼治，諸藥合用共奏“化瘀解毒，疏肝消癰”之效。

綜上所述，內(nèi)異方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥確有療效，其作用機(jī)制初步表明內(nèi)異方有抑制NF-kB 的過(guò)度激活，下調(diào)多種基因和細(xì)胞因子的表達(dá)，減緩細(xì)胞增殖，激活異位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡途徑的作用，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低其在宮腔外的存活及種植能力而抑制異位內(nèi)膜病灶發(fā)展。且缺氧在內(nèi)異癥的治療中有一定意義，提示缺氧微環(huán)境可能與內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系，為內(nèi)異癥的防治提供新思路。