楊愛玲，嚴(yán)素玉，張?zhí)祛?，張彩峰，張碩峰，程 龍，馬 丹，宋敬怡

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100029）

小兒注意缺陷多動(dòng)障礙（attention deficithy peractivity disorder，ADHD）是常見于兒童時(shí)期的精神行為異常性疾病[1-3]。學(xué)齡兒童患病率為2%-10%，并呈逐年上升的趨勢(shì)。ADHD 通常發(fā)病早于6 歲[4]，其中患兒癥狀可持續(xù)到青春期的人數(shù)高達(dá)70%，可延續(xù)至成年的患兒有1/3。臨床上ADHD患病率高，并且多數(shù)患兒共患其他行為障礙，對(duì)患兒整個(gè)成長(zhǎng)過程中的學(xué)習(xí)、生活等產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)ADHD 的研究越來越重視，并成為近年來研究熱點(diǎn)[5]。西醫(yī)治療本病的常用藥鹽酸哌甲酯，該藥起效快、效果滿意[6]，但禁用于6歲以下兒童[7]，隨著臨床投入使用不斷出現(xiàn)的不良反應(yīng)，也嚴(yán)重限制了臨床對(duì)該藥的使用；中藥制劑具有低毒、不良反應(yīng)少、安全的優(yōu)勢(shì)，研發(fā)安全有效的中藥制劑，對(duì)于成長(zhǎng)發(fā)育期的兒童來講極其重要。

目前ADHD 的病因和發(fā)病機(jī)制還未明確[8]，而大量實(shí)驗(yàn)研究表明，ADHD發(fā)病與前額葉、紋狀體通路中的多巴胺能神經(jīng)及其下游有著密切關(guān)系[9-12]?；谘芯堪l(fā)現(xiàn)間接使用多巴胺能神經(jīng)激動(dòng)劑可治療ADHD，研究者提出了ADHD 發(fā)病機(jī)制假說：多巴胺失調(diào)假說[13]，其認(rèn)為ADHD 的發(fā)病可能與腦內(nèi)多巴胺水平調(diào)控失衡有密切關(guān)系。多巴胺是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與調(diào)節(jié)人的情感表達(dá)、運(yùn)動(dòng)能力和認(rèn)知能力等有關(guān)。多項(xiàng)研究表明腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)功能主要通過多巴胺受體調(diào)控其功能，前額葉皮層和紋狀體中DRD1 和DRD2 的高表達(dá)對(duì)機(jī)體活動(dòng)控制和認(rèn)知功能有重要調(diào)節(jié)作用[14-16]。

目前對(duì)于多動(dòng)癥的治療藥物，以化藥為主，例如安非他明類（AdderallXR）以及利他林類藥物（Daytrana），占據(jù)了市場(chǎng)大部分的份額。但由于遠(yuǎn)期療效欠佳及藥物的不良反應(yīng)，限制了其廣泛應(yīng)用[17,18]。另外一類治療AHHD 的化藥如擇思達(dá)，通過調(diào)節(jié)去甲腎上腺素水平，增加突出間隙去甲腎上腺素有效濃度發(fā)揮治療作用，但也有不良反應(yīng)如頭暈、惡心等。小兒處于成長(zhǎng)發(fā)育期，長(zhǎng)期服用化藥治療，對(duì)小兒影響顯著且長(zhǎng)遠(yuǎn)，因而化藥不良反應(yīng)及副作用已日益成為大家所關(guān)注的焦點(diǎn)。中藥制劑具有低毒少副作用的優(yōu)勢(shì)，研發(fā)安全有效的中藥制劑是治療處于成長(zhǎng)發(fā)育期的兒童多動(dòng)癥的重要事項(xiàng)，因此探尋治療ADHD 的安全有效中醫(yī)方藥，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[8]。

本研究采用化藥利他林及小兒黃龍顆粒為陽性藥，利他林代表性中樞神經(jīng)興奮劑；小兒黃龍顆粒為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)的治療ADHD的中藥新藥。

SHR大鼠是國(guó)際上公認(rèn)的ADHD模型大鼠[19,20]，其在4-10 周齡之間呈現(xiàn)出典型ADHD 的癥狀[21]，即多動(dòng)、沖動(dòng)、學(xué)習(xí)記憶障礙，具有良好的表面效度[22]；部分精神興奮劑可對(duì)SHR 大鼠的行為、認(rèn)知異常有改善作用，這增強(qiáng)了SHR 大鼠作為ADHD 動(dòng)物模型的結(jié)構(gòu)效度。在對(duì)SHR 大鼠前額葉、紋狀體內(nèi)遞質(zhì)含量及功能變化的研究中，SHR 大鼠表現(xiàn)出典型的多巴胺含量異常和功能的降低[23]，這與當(dāng)前ADHD 發(fā)病機(jī)制假說多巴胺缺陷理論不謀而合，具有良好的預(yù)測(cè)效度[22]。

本研究采用自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）作為注意力缺陷多動(dòng)障礙（ADHD）大鼠模型[5,6,21]，采用大鼠自主活動(dòng)的行為學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)靜寧顆粒對(duì)ADHD 的治療作用，并應(yīng)用PCR、Western Blot 法測(cè)定SHR 大鼠大腦前額葉、紋狀體部位DRD1、DRD2基因及蛋白表達(dá)水平，探求靜寧顆粒治療ADHD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SHR 大鼠72 只，雌雄各半，體重50-70 g，WKY 大鼠12 只，雌雄各半，體重50-70 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物合格證號(hào)：11400700165636，11400700161596。室溫為（23±2）℃，相對(duì)濕度為（65±5）%，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由攝取食水。

1.2 藥品與試劑

靜寧顆粒，棕褐色粉末，由北京中醫(yī)藥大學(xué)倪健教授提供；臨床人用量為3.38 g·kg-1，大鼠受試劑量為20.25 g·kg-1，10.13 g·kg-1，5.06 g·kg-1。

小兒黃龍顆粒：由重慶希爾安藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格每袋裝5 g，批號(hào)：150501，大鼠受試劑量為0.9375 g·kg-1，為臨床人用量的6 倍。鹽酸哌甲酯緩釋片（利他林）：由西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格18 mg，批號(hào)：41E416，大鼠受試劑量為6.75 mg·kg-1，為臨床人用量的6倍。

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：TIANScript RT Kit；qPCR 試劑盒：SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×) Universal（美國(guó)KAPA Biosystems）；Trizol：invitrogen；Protein lysis buffer（優(yōu)科卓業(yè)生物P001）；BCA Protein Assay Kit（cwbiotech 02912E）；Protein ladder（Biomed）；PVDF membrane，0.45 um（Millipore）；Acrylamide（Amresco 0341）；Bis-Acrylamid（Amresco 0172）；Glycine（Sigma G8898）；SDS（Sigma L4390）；APS（Amresco 0486）；TEMED（Amresco 0761）；Tween-20（Amresco 0777）；Bromphenol Blue（Amresco 0449）；DTT（Amresco 0281）；Trizma base（Sigma T150）；Protease inhibitor cocktail（Roche 04693116001）；Non-fat milk（Erie yili）；ECL（Millipore WBKLS0500）；Methanol（dried）（Sinopharm10014118）；nacl（Sinopharm10019392）；goat anti rabbit IgG（H+L），HRP（Jackson111-035-003）；goat anti mous IgG（H+L），HRP（Jackson115-035-003）。

1.3 主要儀器

AR1140/C型電子分析天平，奧豪斯（上海）公司產(chǎn)品；Noldus 動(dòng)物行為EthovisionXT9.0；高速冷凍離心機(jī)：Beckman Allgre 21R（Beckman 公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；凝膠成像儀：BioSens SC 810B（上海山富科學(xué)儀器有限公司）；分光光度計(jì)：UV-2000（上海菁華科技有限公司）；實(shí)時(shí)定量PCR 儀：ABI7500（USA）；High speed refrigerated centrifuge（XIANGYI）；Multiskan Mircoplate reader（Thermo）；VE180 Mini-protean 3 Dodeca（Tanon）；VE186 TBC（Tanon）；PowerPac HC Power Supply（BioRad）；PH meter（Sartorius）；shaker（Kylin-Bell）；homogenizer（Fluka）。

表1 DRD1，DRD2引物設(shè)計(jì)具體序列

1.4 動(dòng)物分組與給藥

將SHR 大鼠隨機(jī)分為6 組，每組12 只，雌雄各半，即模型組、利他林組、小兒黃龍顆粒組、靜寧顆粒20.25、10.13、5.06 g 生藥/kg 組，另用12 只WKY 大鼠設(shè)為對(duì)照組。各給藥物均按0.5 mL/100 g 體重灌胃給藥，每日1 次，模型組、對(duì)照組灌服去離子水。連續(xù)給藥17 d。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 自主活動(dòng)行為學(xué)測(cè)試

末次給藥1 h 后，將大鼠放在Etho Vision XT 9.0 with the Open Field test 的儀器中，觀察30 min。分別記錄每只大鼠4 個(gè)行為學(xué)指標(biāo)，包括：Distance Moved Total、Velocity、Moving/Center-point Cumulative Duration、Body elongation Normal Cumulative Duration。

1.5.2 腦內(nèi)DRD1、DRD2 mRNA 及蛋白表達(dá)含量檢測(cè)

（1）樣品制備

自主活動(dòng)測(cè)定完成后，各組大鼠均在末次給藥后1 h脫頸椎處死，在冰臺(tái)上迅速分離出大腦兩側(cè)的前額葉皮質(zhì)和紋狀體，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

（2）引物合成

使用ncbi-primer 進(jìn)行設(shè)計(jì)與調(diào)試（表1）：

（3）RT-PCR 方法檢測(cè)各組大鼠額葉皮質(zhì)和紋狀體中DRD1和DRD2的mRNA表達(dá)變化

將已稱重并保存于-80℃冰箱中的組織迅速取出，用液氮研磨后，置于1.5 mL 離心管中，取20 mg 的組織加入1 mL Trizol溶液勻漿，待勻漿充分后，劇烈震蕩20 s，冰上靜止30 min。以每1 mL Buffer RLT 加入200 uL氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置2 min。12 000 rpm 離心10 min，樣品分層后，加入1 倍體積的70%乙醇（RNase-Free Water），混勻。將得到的溶液轉(zhuǎn)入Spin Column RM 中（Spin Column RM 放 入2 mL RNase-free Collection Tube 中）12000 rpm 離 心20 s，棄Collection Tube 中廢液。向Spin Column RM 中加 入350 μL Buffer RW1 8000 xg（10 000 rpm）離心15 s，棄廢液。將Spin Column RM放回2 mL Collection Tube中。向70 μL DNase I Buffer中加入10 μL DNase I，混勻。向Spin Column RM 中直接加入80μL DNase I 混合液，20-30℃孵育15 min。向Spin Column RM 中加入350 μL Buffer RW2 8000 x g（10 000 rpm）離心15 s，棄廢液。將Spin Column RM 放回2 mL Collection Tube 中重復(fù)1 次。將Spin Column RM 放回Collection Tube 中，12 000 rpm 離心1 min。將Spin Column RM 轉(zhuǎn)入新 的 1.5 mL RNase-free Collection Tube 中，加30 μL RNase-free Water，室溫放置1 min，12 000 rpm離心1 min。取8 uL RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

（4）Western-blot 方法檢測(cè)各組大鼠額葉皮質(zhì)和紋狀體中DRD1和DRD2的蛋白表達(dá)變化

前額葉皮質(zhì)和紋狀體用1 mL的RIPA緩沖液勻漿，12 000×g離心后，取上清液。在95%水浴中變性5 min。樣品液經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。用封閉液37℃封閉1 h。封閉后，孵育一抗2 h或4℃靜置過夜。PBST漂洗3次后（每次5 min），二抗室溫孵育1 h。采用暗室曝光顯影膠片。最后，將膠上目的條帶掃描進(jìn)電腦，用Bandscan軟件進(jìn)行灰度分析。

1.5.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上所有結(jié)果運(yùn)用SAS system for windows V8 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠自主活動(dòng)的影響

結(jié)果顯示對(duì)照大鼠移動(dòng)距離、移動(dòng)速率、敞箱中心區(qū)域移動(dòng)累計(jì)時(shí)間、身體拉長(zhǎng)累計(jì)時(shí)間均較模型組大鼠差異明顯（與模型組對(duì)比P＜0.01），模型組大鼠行為與小兒注意缺陷多動(dòng)障礙（attention deficithy peractivity disorder，ADHD）患兒活動(dòng)過度、焦慮的表現(xiàn)相一致。靜寧顆粒各劑量可明顯縮短SHR 大鼠在敞箱的移動(dòng)距離和在敞箱中心區(qū)域移動(dòng)累計(jì)時(shí)間（與模型組相比P＜0.05，P＜0.01），靜寧顆粒20.25 g·kg-1可明顯降低SHR 大鼠的移動(dòng)速率（與模型組相比P＜0.05）。靜寧顆粒各劑量可不同程度減少身體拉長(zhǎng)累計(jì)時(shí)間（與模型組相比P＞0.05）（表2，表3）。

表2 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠自主活動(dòng)的影響（1）（±s，n=12）

表2 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠自主活動(dòng)的影響（1）（±s，n=12）

注：與模型組相比*P ＜0.05，**P ＜0.01

2.2 靜寧顆粒對(duì)ADHD 模型大鼠多巴胺能神經(jīng)的影響

2.2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，模型組大鼠腦前額葉、紋狀體中DRD1，DRD2 mRNA 相對(duì)含量均較WKY 大鼠不同程度的減少，其中紋狀體中DRD1，DRD2 mRNA 相對(duì)含量明顯減少（與模型組相比P＜0.05）。靜寧顆粒20.25 g·kg-1可不同程度增加SHR 大鼠腦前額葉、紋狀體中DRD1，DRD2 mRNA 相對(duì)含量，但與模型組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4，表5）。

2.2.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果

SHR 大鼠腦前額葉、紋狀體中DRD1、DRD2 蛋白表達(dá)量均較WKY 大鼠明顯減少（P＜0.05）。靜寧顆粒各劑量均可明顯抑制SHR 大鼠腦前額葉、紋狀體中DRD1 蛋白表達(dá)減少（與模型組相比P＜0.05）；靜寧顆粒20.25、10.13 g·kg-1可明顯抑制SHR 大鼠大腦前額葉、紋狀體中DRD2 蛋白表達(dá)減少（與模型組相比P＜0.05），靜寧顆粒20.25 g·kg-1可明顯抑制SHR 大鼠大腦紋狀體中DRD2 蛋白表達(dá)減少（與模型組相比P＜0.05）（表6，表7）。

3 討論

小兒注意缺陷多動(dòng)障礙（ADHD），亦稱小兒多動(dòng)癥，患兒與同齡兒童相比，有明顯的多動(dòng)、學(xué)習(xí)或記憶障礙的一組綜合征。ADHD是兒童時(shí)期最為常見的行為障礙，學(xué)齡兒童患病率高，并呈逐年上升的趨勢(shì)。

表3 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠自主活動(dòng)的影響（2）（±s，n=12）

表3 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠自主活動(dòng)的影響（2）（±s，n=12）

注：與模型組相比*P ＜0.05，**P ＜0.01

表4 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠大腦前額葉中DRD1，DRD2 mRNA相對(duì)含量的影響（±s，n=4）

表4 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠大腦前額葉中DRD1，DRD2 mRNA相對(duì)含量的影響（±s，n=4）

表5 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠大腦紋狀體中DRD1，DRD2 mRNA相對(duì)含量的影響（±s，n=4）

表5 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠大腦紋狀體中DRD1，DRD2 mRNA相對(duì)含量的影響（±s，n=4）

注：與模型組相比*P ＜0.05

表6 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠大腦前額葉受體表達(dá)的影響（±s，n=4）

表6 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠大腦前額葉受體表達(dá)的影響（±s，n=4）

注：與模型組相比*P ＜0.05

表7 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠大腦紋狀體受體表達(dá)的影響（±s，n=4）

表7 靜寧顆粒對(duì)ADHD模型大鼠大腦紋狀體受體表達(dá)的影響（±s，n=4）

注：與模型組相比*P ＜0.05

傳統(tǒng)中醫(yī)對(duì)ADHD 沒有專門記載，根據(jù)其臨床主癥來看，可以歸于“臟躁”、“躁動(dòng)”等疾病范疇；該病總體主要原因是陰陽失衡，臟腑失調(diào)，根本病癥是虛癥，輔助病癥是虛癥，即虛證為主，實(shí)證為輔，“心、肝、脾、腎、肺、腦”為其病位?！瓣庩柺д{(diào)，陰虛為主，陰靜不足，陽亢有余，因而陰不能制陽；臟腑陰陽失調(diào)，五臟均受其損害，神傷為主”為病機(jī)要點(diǎn)。針對(duì)此特點(diǎn)王俊宏教授根據(jù)多年來臨床患兒的用藥經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出了靜寧顆粒經(jīng)驗(yàn)方[24]。該方由太子參、熟地、枸杞子、五味子、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓等組成。方由太子參、熟地補(bǔ)脾補(bǔ)血，益氣益精，生津養(yǎng)陰，共為君藥；枸杞子、五味子補(bǔ)血補(bǔ)腎，安神寧心，共為臣藥；遠(yuǎn)志、石菖蒲安神開竅醒神益智，茯苓健脾補(bǔ)中共為佐使藥。全方益氣養(yǎng)陰，寧心安神，突破傳統(tǒng)的中醫(yī)治療多動(dòng)癥的思路，從更深層面上研究其中醫(yī)病機(jī)“陰陽失調(diào)”，突出“陰平陽秘，精神乃治”的中醫(yī)理論?，F(xiàn)代藥理研究也表明，遠(yuǎn)志、石菖蒲具有鎮(zhèn)靜安神，醒神開竅的作用[25]，可改善SHR 大鼠多動(dòng)癥狀[26]。本研究使用Noldus 動(dòng)物行為分析系統(tǒng)評(píng)價(jià)SHR 大鼠的自主活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SHR 大鼠的移動(dòng)距離、移動(dòng)速率、敞箱中心區(qū)域移動(dòng)累計(jì)時(shí)間、身體拉長(zhǎng)累計(jì)時(shí)間均較WKY 大鼠明顯增加，顯示了SHR 模型大鼠具有多動(dòng)、焦慮的癥狀，與臨床上ADHD 的癥狀極為相似，而靜寧顆粒連續(xù)灌胃給藥17 d 可明顯逆轉(zhuǎn)上述SHR 大鼠行為特征，提示靜寧顆粒具有治療ADHD的作用。

注意缺陷多動(dòng)障礙（ADHD）的病因和發(fā)病機(jī)制目前研究尚未明確，目前臨床主要采用中樞興奮劑進(jìn)行治療。研究表明ADHD 發(fā)病與前額葉和紋狀體功能障礙有關(guān)，前額葉是維持注意、控制沖動(dòng)等行為活動(dòng)的重要調(diào)控部位，紋狀體是神經(jīng)環(huán)路與前額葉皮質(zhì)相連形成認(rèn)知調(diào)控的重要通路的組成部分，并對(duì)隨意運(yùn)動(dòng)的穩(wěn)定、肌緊張的控制、本體感覺沖動(dòng)信息的處理有著調(diào)節(jié)作用。近年來，許多研究者提出了諸多ADHD 發(fā)病機(jī)制假說，其中“多巴胺缺陷理論”被普遍接受的假說之一，因而對(duì)多巴胺系統(tǒng)的研究很重要。多巴胺的受體分為D1樣和D2樣，DRD1和DRD2的高表達(dá)與機(jī)體活動(dòng)和認(rèn)知功能相關(guān)[27-29]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究表明靜寧顆?？娠@著升高大鼠大腦腦前額葉、紋狀體中DRD1、DRD2 蛋白表達(dá)量，提示靜寧顆粒治療ADHD 作用機(jī)制可能與影響多巴胺能神經(jīng)作用，增加前額葉、紋狀體中DRD1、DRD2蛋白表達(dá)量有關(guān)，這與中醫(yī)病機(jī)“陰陽失調(diào)”，突出“陰平陽秘，精神乃治”的中醫(yī)理論相吻合。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明靜寧顆粒對(duì)ADHD 模型大鼠行為具有一定干預(yù)作用，ADHD 模型大鼠的自主活動(dòng)顯著減少，提示靜寧顆粒對(duì)ADHD 具有一定的治療作用。靜寧顆粒益氣養(yǎng)陰，寧心安神，主要適用于具有氣陰兩虛證的小兒多動(dòng)癥，其突破傳統(tǒng)的中醫(yī)治療思路，從更深層面上研究了其中醫(yī)病機(jī)“陰陽失調(diào)”，突出“陰平陽秘，精神乃治”的中醫(yī)理論。進(jìn)一步研究表明靜寧顆?？娠@著升高大鼠大腦腦前額葉、紋狀體中DRD1、DRD2 蛋白表達(dá)量，提示靜寧顆粒治療ADHD作用機(jī)制可能與影響多巴胺能神經(jīng)作用，增加其下游蛋白表達(dá)量有關(guān)，這與中醫(yī)病機(jī)“陰陽失調(diào)”，突出“陰平陽秘，精神乃治”的中醫(yī)理論相吻合。在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下治療ADHD 獲得良好的治療效果，目前未發(fā)現(xiàn)毒副作用，在治療和改善ADHD 癥狀方面具有重要的意義。