張 瑩 秦宇軒 尚慶茂 張一凡 李昌輝 李平蘭

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所， 北京 100081)

0 引言

植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根際的一類(lèi)促進(jìn)植物生長(zhǎng)及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收和利用，抑制有害微生物的生防益生菌[1]。而PGPR在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，會(huì)直接受到附生植物根系分泌物的影響。植物的根系分泌物是調(diào)控植物-根際微生物的關(guān)鍵因素，是研究PGPR與宿主植物互作影響與機(jī)制的關(guān)鍵[2]。

根系分泌物作為植物與土壤進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要載體物質(zhì)，主要是指植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，通過(guò)根分泌的方式向根周?chē)尫乓恍o(wú)機(jī)離子和有機(jī)化合物，這些物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為根系分泌物[3]。研究發(fā)現(xiàn)，根系分泌物中含有的諸如糖、氨基酸和有機(jī)酸等低分子量物質(zhì)，對(duì)植物-微生物種間互作發(fā)揮著重要作用[4]。而對(duì)于PGPR來(lái)說(shuō)，這些成分不但可以作為其良好的碳源，還常作為信號(hào)分子起到趨化作用，促進(jìn)其在根際定殖[5]。DE等[6]發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌WCS365受到番茄根系分泌物中的蘋(píng)果酸和檸檬酸的趨化作用，并且根系分泌物會(huì)影響菌株鞭毛的運(yùn)動(dòng)性；PETERS等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在缺氮條件下，豆科植物的根系通過(guò)分泌類(lèi)黃酮來(lái)誘導(dǎo)啟動(dòng)根瘤菌的結(jié)瘤基因nodD的表達(dá)，最終導(dǎo)致根瘤菌成功侵染根系并形成根瘤；某些PGPR能夠利用植物根系分泌物的成分作為生物合成的前體，研究表明，燕麥會(huì)在根尖部分泌色氨酸用于PGPR轉(zhuǎn)化為生長(zhǎng)素(吲哚乙酸)，進(jìn)而促進(jìn)自身的生長(zhǎng)[8]。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)L-S60是一株分離自土壤，具有優(yōu)良促生抗病特性的植物根際促生菌[9]，應(yīng)用于植物生防方面具有很大的潛力。為了更好地理解植物根際促生菌與植物互作這一復(fù)雜過(guò)程，本研究分析淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜(CucumissativusL.)的互作過(guò)程。由于對(duì)根際分泌物的趨化和運(yùn)動(dòng)性是微生物定殖根際的前提條件，首先研究黃瓜根系分泌物的主要成分有機(jī)酸及氨基酸對(duì)菌株的的趨化作用及菌株的利用情況。在建立菌株與黃瓜幼苗互作模型后，通過(guò)計(jì)數(shù)的方式研究菌株在水培黃瓜幼苗根系表面的定殖量隨時(shí)間變化的關(guān)系，并且通過(guò)熒光定量PCR的方式分析與黃瓜根系互作后菌株和根際定殖、群集運(yùn)動(dòng)、生物被膜形成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

解淀粉芽孢桿菌L-S60，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院應(yīng)用微生物研究室提供。

黃瓜品種為“中農(nóng)6號(hào)”，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。

1.2 菌株受黃瓜根系分泌物成分影響的確定

1.2.1有機(jī)酸成分對(duì)菌株的趨化試驗(yàn)

將ADLER[10]的方法略作修改，進(jìn)行菌株對(duì)有機(jī)酸趨化作用的定量測(cè)定，將不同濃度(50、100、200 μmol/L)的有機(jī)酸趨化液(將檸檬酸、草酸、琥珀酸及蘋(píng)果酸4種有機(jī)酸分別溶于PBS緩沖液，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌)取5 mL加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將活菌數(shù)約為108CFU/mL的菌液離心后重懸在等體積的無(wú)菌PBS緩沖液中，將吸有菌懸液的內(nèi)徑1 mm、長(zhǎng)度3 cm的無(wú)菌毛細(xì)管分別放入上述6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃靜置1 h，以不加有機(jī)酸的PBS緩沖液為空白對(duì)照，將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的有機(jī)酸趨化液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.2.2菌株對(duì)有機(jī)酸的利用試驗(yàn)

將活菌數(shù)約為108CFU/mL的菌液以0.5%的接種量接種于pH值調(diào)節(jié)為5.5、濃度200 μmol/L的有機(jī)酸(檸檬酸、草酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸)Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[11]中，以不加有機(jī)酸的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(pH值5.5)為空白對(duì)照，37℃、200 r/min培養(yǎng)12、36 h，采用平板計(jì)數(shù)的方式計(jì)算培養(yǎng)液中的菌數(shù)。

1.2.3氨基酸成分對(duì)菌株的趨化試驗(yàn)

不同質(zhì)量濃度(5、10、20 μg/mL)的氨基酸趨化液(將谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸及色氨酸4種氨基酸分別溶于PBS緩沖液，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌)分別取5 mL加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，其余步驟同1.2.1節(jié)。

1.2.4菌株對(duì)氨基酸的利用試驗(yàn)

將活菌數(shù)約為108CFU/mL的菌液以0.5%的接種量接種于pH值調(diào)節(jié)為5.5、質(zhì)量濃度20 μg/mL的氨基酸(谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸)Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，其余步驟同1.2.2節(jié)。

1.3 菌株與黃瓜幼苗互作模型的建立

參照GRAHAM等[12]的方法且適當(dāng)修改，具體方法如下：

(1)種子催芽：取黃瓜種子若干，用清水浸泡2 h，75%乙醇浸泡1 min，5%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，無(wú)菌水沖洗至無(wú)刺鼻氣味。在滅菌的培養(yǎng)皿(內(nèi)墊有無(wú)菌水潤(rùn)濕的濾紙)中加入適量的無(wú)菌水，每皿放置約40粒消毒種子，室溫(20℃)放置1 h后轉(zhuǎn)至暗處，28℃培養(yǎng)48 h。

(2)將催芽后的種子播種于裝有滅菌無(wú)土栽培基質(zhì)(蛭石與珍珠巖體積比為1∶1)的穴盤(pán)中，置于28℃光照培養(yǎng)箱(16 h光照，8 h黑暗)，每隔24 h用2倍稀釋的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液灌根，直至長(zhǎng)出第1片真葉(播種后約14 d)。

(3)將穴盤(pán)取出，在每孔中加入過(guò)量的無(wú)菌水，小心拔出黃瓜幼苗，盡量不破壞幼苗的根系，用無(wú)菌水洗凈根表面的基質(zhì)，每20棵黃瓜苗根系浸入添加50 μg/mL利福平的200 mL滅菌水中，2 h后用無(wú)菌水洗凈根系。

(4)將活菌數(shù)約為108CFU/mL的菌液離心后重懸在等體積的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，吸取5 mL加入含有45 mL Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的50 mL錐形瓶中，每瓶加入5棵處理好的黃瓜苗，用無(wú)菌脫脂棉封口及固定黃瓜苗。將錐形瓶用錫紙包好(植物根系需避光生長(zhǎng))，在28℃光照培養(yǎng)箱(16 h光照，8 h黑暗)中培養(yǎng)。

1.4 菌株在水培黃瓜幼苗根系表面定殖量測(cè)定

按不同培養(yǎng)時(shí)間(6、12、18、24、36、48 h)將黃瓜幼苗根系移出，用無(wú)菌水沖洗掉根系表面的菌株后，切取1 g根系置于9 mL無(wú)菌生理鹽水中，渦旋1 min，平板計(jì)數(shù)。

1.5 菌株定殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異

1.5.1細(xì)菌總核糖核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄

按不同培養(yǎng)時(shí)間(0.25、0.5、1、2、4、6、8 h)將植物根系移除后，將菌液低溫離心，棄上清液后加入液氮研磨，采用TRIzol法提取細(xì)菌總核糖核酸(RNA)[13]。將提取后的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：RNA 5 μg，Random Primer 1 μL，5×RT Reaction Mix 4 μL，TUREscript H-Rtase 0.8 μL，加DEPC水至總反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件：25℃，10 min；42℃，30 min；65℃，15 min。

1.5.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)菌株與根際定殖、群集運(yùn)動(dòng)、生物被膜形成相關(guān)功能的共17個(gè)基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表1)，采用20 μL反應(yīng)體系對(duì)基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，其中SYBR(2×)qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板為1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：95℃，30 s；95℃，5 s；62℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析參考MORISSET等[14]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株受黃瓜根系分泌物成分的影響

2.1.1有機(jī)酸成分對(duì)菌株的趨化試驗(yàn)

由圖1可知，檸檬酸、草酸、琥珀酸及蘋(píng)果酸4種有機(jī)酸對(duì)解淀粉芽孢桿菌L-S60均具有正趨化作用，整體來(lái)看，有機(jī)酸對(duì)于L-S60的趨化作用都較為微弱，且趨化作用對(duì)有機(jī)酸的濃度有較強(qiáng)的依賴(lài)性。其中，蘋(píng)果酸對(duì)L-S60的趨化作用最強(qiáng)，以濃度為200 μmol/L時(shí)為最佳；而草酸和檸檬酸對(duì)菌株的趨化作用相對(duì)較弱。

2.1.2菌株對(duì)有機(jī)酸的利用試驗(yàn)

由圖2可知，解淀粉芽孢桿菌L-S60能夠利用蘋(píng)果酸作為唯一的碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，在培養(yǎng)36 h時(shí)，活菌數(shù)依然保持上升趨勢(shì)。而L-S60利用其他3種有機(jī)酸的效果并不明顯，雖然活菌數(shù)都高于空白對(duì)照，但仍為下降趨勢(shì)。

表1 與根際定殖、群集運(yùn)動(dòng)、生物被膜形成相關(guān)基因引物序列Tab.1 Primers sequence of genes involved in root colonization, swarming motility and biofilm formation

圖1 有機(jī)酸對(duì)L-S60的趨化作用Fig.1 Chemotaxis toward organic acid from L-S60

圖2 L-S60對(duì)有機(jī)酸的利用Fig.2 Utilization of organic acids by L-S60

2.1.3氨基酸成分對(duì)菌株的趨化試驗(yàn)

圖3 氨基酸對(duì)L-S60的趨化作用Fig.3 Chemotaxis toward amino acid from L-S60

由圖3可知，谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和色氨酸4種氨基酸對(duì)解淀粉芽孢桿菌L-S60均具有正趨化作用，整體來(lái)看，氨基酸對(duì)于L-S60的趨化作用都較為微弱，且趨化作用對(duì)氨基酸的濃度有較強(qiáng)的依賴(lài)性。其中，谷氨酸對(duì)L-S60的趨化作用最強(qiáng)，而其他3種氨基酸的趨化作用相對(duì)較弱。

2.1.4菌株對(duì)氨基酸的利用試驗(yàn)

由圖4可知，解淀粉芽孢桿菌L-S60對(duì)于4種氨基酸的利用效果并不明顯，雖然活菌數(shù)都高于空白對(duì)照，但仍為下降趨勢(shì)。其中，L-S60對(duì)谷氨酸的利用情況最優(yōu)，在培養(yǎng)12 h及36 h時(shí)，添加谷氨酸的培養(yǎng)液中活菌數(shù)顯著大于空白對(duì)照及其他種類(lèi)的氨基酸。

圖4 L-S60對(duì)氨基酸的利用Fig.4 Utilization of amino acid by L-S60

2.2 菌株在水培黃瓜幼苗根系表面的定殖量

由圖5可知，L-S60具有在黃瓜幼苗根系表面定殖的能力，且根據(jù)定殖菌數(shù)隨時(shí)間變化的趨勢(shì)，在菌株與黃瓜幼苗根際共培養(yǎng)初期，定殖量隨時(shí)間的增長(zhǎng)而變大，而在共培養(yǎng)18 h時(shí)，菌株定殖量達(dá)到最大，L-S60的定殖量為1.02×105CFU/g。而共培養(yǎng)18 h后，菌株的定殖量隨時(shí)間的增長(zhǎng)而逐漸變小。

圖5 菌株在黃瓜根系表面的定殖量Fig.5 Viable count of L-S60 colonizing cucumber root

2.3 菌株定殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異

2.3.1表面黏附相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異

L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時(shí)間后，sacB、ycdH及yfiQ3個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平差異見(jiàn)圖6。整體來(lái)看，3個(gè)與表面黏附相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)上調(diào)，尤其是在互作4 h左右，表達(dá)顯著上調(diào)，因此認(rèn)為菌株在黃瓜幼苗根系有黏附現(xiàn)象的發(fā)生。

圖6 L-S60在不同處理時(shí)間sacB、ycdH及yfiQ基因轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.6 Difference of sacB, ycdH and yfiQ gene translational levels of L-S60 at different times

2.3.2表面活性素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異

L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時(shí)間后的sfp、yczE、srfAA及comP4個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平差異見(jiàn)圖7。整體來(lái)看，除yczE在處理6 h后表達(dá)下調(diào)外，其他基因在處理不同時(shí)間時(shí)整體都表達(dá)上調(diào)，尤其是在互作0.25～0.5 h左右，4個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，因此認(rèn)為菌株在與黃瓜幼苗根系接觸的過(guò)程中會(huì)分泌表面活性素。

圖7 L-S60在不同處理時(shí)間sfp、yczE、srfAA及comP基因轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.7 Difference of sfp, yczE, srfAA and comP gene translational levels of L-S60 at different times

2.3.3群集運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異

L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時(shí)間后的efp、swrB及swrA3個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平差異見(jiàn)圖8。整體來(lái)看，3個(gè)基因隨著處理時(shí)間的增加表達(dá)水平由上調(diào)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橄抡{(diào)，因此認(rèn)為菌株與黃瓜幼苗根系接觸初期群集運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng)，而后期菌株逐漸黏附在植物根系，形成了生物被膜。

圖8 L-S60在不同處理時(shí)間efp、swrB及swrA基因轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.8 Difference of efp, swrB and swrA gene translational levels of L-S60 at different times

2.3.4生物被膜合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異

L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時(shí)間后的spo0A、sigH、sinR、epsA、yqxM、sipW及tasA7個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平差異見(jiàn)圖9。整體來(lái)看，spo0A、sigH及sinR為生物被膜形成過(guò)程中的全局調(diào)控因子，spo0A、sigH表達(dá)出現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)，而sinR表達(dá)出現(xiàn)逐漸下調(diào)的趨勢(shì)；在處理時(shí)間8 h左右，epsA的表達(dá)水平上調(diào)并不明顯，而yqxM-sipW-tasA操縱子表達(dá)均上調(diào)，因此認(rèn)為菌株與黃瓜幼苗根系互作過(guò)程中能夠形成生物被膜。

圖9 L-S60在不同處理時(shí)間spo0A、sigH、sinR、epsA、yqxM、sipW及tasA基因轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.9 Difference of spo0A, sigH, sinR, epsA, yqxM, sipW and tasA gene translational levels of L-S60 at different times

3 討論

3.1 菌株受黃瓜根系分泌物成分的影響

一般來(lái)說(shuō)，根系分泌物被認(rèn)為是影響根際微生物行為和分布的重要因素，由于它們中不同的組分會(huì)在根系的不同部位呈現(xiàn)不同的濃度分布，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)不同組分有趨化性及偏好性的微生物會(huì)呈現(xiàn)出不同的趨化性與定殖行為[15]。RUDRAPPA等[16]發(fā)現(xiàn)擬南芥受病原菌侵染后分泌的蘋(píng)果酸可以誘導(dǎo)根際促生菌(枯草芽孢桿菌)定殖；LING等[17]研究發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果酸和檸檬酸可以促進(jìn)多粘類(lèi)芽孢桿菌SQR-21在西瓜根際的定殖。HEINRICH等[18]研究了小麥根分泌物對(duì)其根際細(xì)菌Azospirilliumlipoferum的趨化作用，認(rèn)為根系分泌物中的氨基酸組分是一種正趨化物質(zhì)；樂(lè)毅全等[19]研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌No.5對(duì)鳳眼蓮根系分泌物中的亮氨酸、絲氨酸、纈氨酸具有正趨化性。

KAMILOVA等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜根系分泌物中含量最多的4種有機(jī)酸為檸檬酸、草酸、琥珀酸和蘋(píng)果酸，因此本試驗(yàn)研究這4種主要有機(jī)酸對(duì)菌株的趨化作用及菌株的利用情況。結(jié)果顯示，這4種有機(jī)酸菌對(duì)L-S60均具有正趨化作用，且蘋(píng)果酸的趨化作用最強(qiáng)。而菌株對(duì)除蘋(píng)果酸外其他3種有機(jī)酸的利用效果并不明顯，這可能是由于培養(yǎng)液中有機(jī)酸濃度較低，營(yíng)養(yǎng)成分不足以讓菌株生長(zhǎng)，只能減緩其死亡的速度。

KIMANI等[21]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜根系分泌物中含量最多的3種氨基酸為谷氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸。而色氨酸是植物生長(zhǎng)素吲哚乙酸(IAA)的前體，對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育起到重要的作用，因此本試驗(yàn)研究這4種氨基酸對(duì)菌株的趨化作用。結(jié)果顯示，4種氨基酸對(duì)L-S60均具有正趨化作用，且谷氨酸的趨化作用最強(qiáng)。而菌株對(duì)于4種氨基酸的利用效果均并不明顯，雖然活菌數(shù)都高于空白對(duì)照，但仍為下降趨勢(shì)，這可能是由于培養(yǎng)液中氨基酸濃度較低，營(yíng)養(yǎng)成分不足以讓菌株生長(zhǎng)，只能減緩其死亡的速度。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，解淀粉芽孢桿菌L-S60對(duì)黃瓜根系分泌的4種有機(jī)酸及氨基酸具有正趨化作用，并且能夠分別利用其中部分有機(jī)酸和氨基酸，這為菌株能夠在黃瓜幼苗根系定殖提供了有力的理論依據(jù)。此外，根系分泌物具體成分在植物-微生物互作方面的詳細(xì)機(jī)制目前尚未明了，有待進(jìn)一步研究。

3.2 菌株在黃瓜幼苗根系定殖情況

本試驗(yàn)采用水培黃瓜幼苗的方式建立了解淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜根系互作的模型，首先通過(guò)計(jì)數(shù)的方式考察了菌株在黃瓜幼苗根系的定殖情況。雖然在共培養(yǎng)18 h時(shí)達(dá)到了最大定殖量，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的定殖量降低較大。這可能是由于在模型建立的初始，菌株能夠利用黃瓜根系分泌出的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生存，但由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，水培營(yíng)養(yǎng)液中又沒(méi)有菌株可利用的能源，導(dǎo)致菌株由于環(huán)境惡劣的原因轉(zhuǎn)變成芽孢休眠狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致根際定殖量的下降。而劉健等[22]也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的情況，巨大芽孢桿菌在小麥根際定殖量也會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

本試驗(yàn)通過(guò)熒光定量PCR的方式研究了與黃瓜互作菌株定殖相關(guān)17個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，為了方便討論，將這17個(gè)基因分為4類(lèi)：①sacB、ycdH及yfiQ3個(gè)基因均與細(xì)菌在根系的表面黏附過(guò)程相關(guān)，sacB表達(dá)果聚糖蔗糖酶(胞外)，產(chǎn)物果聚糖與細(xì)菌的根系粘附定殖相關(guān)[23]；ycdH表達(dá)高親和性Zn2+ABC運(yùn)輸脂蛋白，與細(xì)菌在根系的表面粘附過(guò)程相關(guān)[24]；yfiQ表達(dá)細(xì)菌的表面粘附蛋白[24]。②sfp、yczE、srfAA及comP4個(gè)基因均與表面活性素合成過(guò)程相關(guān)，sfp表達(dá)脂肽和聚酮化合物(主要抗菌物質(zhì))合成必須的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶[25-26]；yczE表達(dá)影響脂肽和聚酮化合物合成的跨膜蛋白[25-26]；srfABCD表達(dá)Surfactin(表面活性素)合成酶[25]，其中srfAA為srfABCD基因簇中的關(guān)鍵基因；comP表達(dá)ComX傳感器激酶，調(diào)控Surfactin的合成[26]。③efp、swrB及swrA3個(gè)基因均與表面活性素合成過(guò)程相關(guān)，efp表達(dá)延伸因子P(Elongation factor P)類(lèi)似蛋白，為細(xì)菌群集運(yùn)動(dòng)所必需的蛋白[27]；swrA和swrB表達(dá)群集運(yùn)動(dòng)所必需的蛋白(Swarming protein)[27]。④spo0A、sigH、sinR、epsA、yqxM、sipW及tasA7個(gè)基因均與生物被膜的合成過(guò)程相關(guān)，spo0A表達(dá)產(chǎn)孢的全局調(diào)控因子，在生物被膜形成的初始階段起著重要的作用[28]；sigH表達(dá)RNA聚合酶相關(guān)的調(diào)控因子σH因子(Sigma factor H)，在芽孢生成階段調(diào)控spo0A啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，但不影響生物被膜的起始，對(duì)生物被膜中輻射狀結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)發(fā)揮了重要的作用[28-29]；sinR表達(dá)生物被膜形成的全局調(diào)控因子，負(fù)調(diào)控生物被膜的形成[30]；epsA-O表達(dá)胞外多糖生物合成操縱子，為合成生物被膜所必需[31]，其中epsA為epsA-O基因簇中的關(guān)鍵基因；yqxM-sipW-tasA操縱子表達(dá)合成生物被膜基質(zhì)的主要蛋白，yqxM能夠合成脂蛋白，sipW表達(dá)Ⅰ型信號(hào)肽酶，tasA表達(dá)芽孢外壁形成的相關(guān)蛋白[32]。其中，磷酸化的Spo0A會(huì)促進(jìn)下游sinI基因的表達(dá)，sinI為sinR的對(duì)抗物，sinI會(huì)解除sinR對(duì)epsA-O和yqxM-sipW-tasA操縱子的抑制作用，進(jìn)而正向調(diào)控生物被膜的形成。此外，表面活性素作為一種自我誘導(dǎo)劑也能夠促進(jìn)yqxM基因的表達(dá)，促進(jìn)生物被膜的形成。

將L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時(shí)間后，4類(lèi)與菌株定殖相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平具有較為顯著的差異變化：①sacB、ycdH及yfiQ3個(gè)基因在不同處理時(shí)間都表達(dá)上調(diào)，尤其是在互作4 h左右表達(dá)顯著上調(diào)，可能是由于菌株在與黃瓜幼苗根系接觸一段時(shí)間后，黏附相關(guān)的蛋白才會(huì)大量表達(dá)。②除yczE在處理6 h后表達(dá)下調(diào)外，sfp、srfAA及comP3個(gè)基因在處理不同時(shí)間時(shí)整體都表達(dá)上調(diào)，尤其是在互作0.25～0.5 h左右，4個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，可能是由于表面活性素在菌株與黃瓜幼苗根系接觸初期發(fā)揮作用，因此相關(guān)基因的表達(dá)水平在接觸初期會(huì)呈現(xiàn)顯著的上調(diào)。③efp、swrB及swrA3個(gè)基因隨著處理時(shí)間的增加表達(dá)水平由上調(diào)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橄抡{(diào)，可能是由于菌株與黃瓜幼苗根系接觸初期其根系分泌物中的信號(hào)分子對(duì)菌株由趨化作用，菌株的群集運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng)，基因表達(dá)水平上調(diào)；而隨著處理時(shí)間的增加，菌株逐漸黏附在植物根系，形成生物被膜，運(yùn)動(dòng)能力下降，基因水平表達(dá)下調(diào)。④spo0A、sigH表達(dá)出現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)，而sinR表達(dá)出現(xiàn)逐漸下調(diào)的趨勢(shì)。3個(gè)全局調(diào)控因子表達(dá)水平的不同步可能是由于對(duì)照組(0 h)菌株沒(méi)有與植物根系接觸，環(huán)境相比于同根系共培養(yǎng)的菌株更為惡劣，刺激菌株產(chǎn)孢，因而導(dǎo)致初始對(duì)照組的spo0A表達(dá)水平上調(diào)；而隨著處理時(shí)間的增加，菌株逐漸在黃瓜根系黏附，開(kāi)始形成生物被膜，因此表達(dá)水平下調(diào)。在處理時(shí)間8 h左右，sinR表達(dá)下調(diào)，epsA-O及yqxM-sipW-tasA這兩個(gè)操縱子表達(dá)均上調(diào)。但epsA的表達(dá)水平上調(diào)并不明顯，可能是處理時(shí)間較短造成的，此時(shí)epsA-O中其他基因可能參與了調(diào)控。根據(jù)這4類(lèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平差異，從分子的水平上檢測(cè)出了菌株在與黃瓜幼苗根系互作的過(guò)程中，發(fā)生了根際定殖的現(xiàn)象。

本試驗(yàn)采用水培黃瓜幼苗的方式建立的解淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜根系互作的模型，雖然具有易于收集菌體、菌株及黃瓜幼苗受其他外界條件干擾小的優(yōu)點(diǎn)，且從短期培養(yǎng)結(jié)果上來(lái)看也比較接近菌株的定殖行為，但長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)其厭氧的水培環(huán)境不利于好氧微生物的生命活動(dòng)，因此建立更為真實(shí)的模擬菌株與植物根系互作模型問(wèn)題還有待解決。

4 結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)對(duì)解淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜互作過(guò)程的研究，確定了菌株能夠部分利用黃瓜根系分泌物的主要成分有機(jī)酸(檸檬酸、草酸、琥珀酸和蘋(píng)果酸)及氨基酸(谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和色氨酸)成分，且受到這些成分的趨化作用，其中對(duì)于蘋(píng)果酸和谷氨酸的利用情況及受趨化作用最優(yōu)。在建立了菌株與黃瓜幼苗互作模型后，通過(guò)計(jì)數(shù)的方式研究了菌株在水培黃瓜幼苗根系表面的定殖量隨時(shí)間變化的關(guān)系，并且通過(guò)熒光定量PCR的方式，從與黃瓜根系互作后菌株與根際定殖、群集運(yùn)動(dòng)、生物被膜形成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異上分析，菌株具有在黃瓜幼苗根系表面定殖的能力，且菌株最大定殖量為1.02×105CFU/g。