李鵬飛，高 峰，張艷輝

乙型肝炎嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。目前，由于乙肝疫苗的推廣及抗病毒藥物的使用，乙肝發(fā)生率大大降低[1]，但乙肝感染仍然是威脅人類健康的主要原因。乙肝病毒DNA檢測定量對于評估抗病毒治療、免疫應(yīng)答監(jiān)控及耐藥檢測至關(guān)重要。實時定量PCR是定量檢測HBV-DNA的常用方法。檢測系統(tǒng)性能評價是臨床實驗室檢驗質(zhì)量管理的重要內(nèi)容之一。GB/T 22576-2008文件規(guī)定：臨床實驗室應(yīng)當(dāng)驗證廠家提供的檢驗方法或試劑盒相關(guān)分析性能以評估其性能指標(biāo)是否符合預(yù)期[2]。要求性能驗證至少應(yīng)包括精密度、正確度、線性、測量和(或)可報告范圍等內(nèi)容[3]。本研究通過對相關(guān)文件進(jìn)行認(rèn)真解讀，設(shè)計實驗方案，參考實驗室所用中山達(dá)安公司生產(chǎn)的HBV-DNA定量試劑盒中有關(guān)產(chǎn)品性能指標(biāo)，旨在驗證本室ABI QuantistudioDx實時熒光定量 PCR儀性能。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 實時定量PCR儀(美國ABI Quantistudio Dx公司)，高速冷凍離心機(jī)5804R(德國eppendorf Centrifuge公司)，MK-10干式恒溫器(杭州奧盛公司)、SteriGard 生物安全柜(Baker公司)及配套有關(guān)型號的加樣槍等。乙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒PCR-熒光探針法由中山達(dá)安公司提供，試劑批號：2017001。

1.2 標(biāo)本 質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品為中山達(dá)安乙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒配套。室間質(zhì)評標(biāo)本由衛(wèi)生部臨床檢驗中心發(fā)放。檢測樣本取自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診及住院患者。

1.3 方法

1.3.1 HBV提取及檢測 按照本實驗室提供的SOP操作規(guī)程進(jìn)行核酸提取及HBV DNA PCR擴(kuò)增。

1.3.2 精密度驗證 選取配好的高濃度(1.00×106U/ml)、低濃度(1.00×104U/ml)樣本進(jìn)行檢測。批內(nèi)精密度評價標(biāo)本測定按照規(guī)定的操作方法[4]，在1 d內(nèi)各做20次重復(fù)測定，計算均值、標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)。批間精密度選擇室內(nèi)質(zhì)控作為衡量批間精密度的依據(jù)。選取檢測20 d的數(shù)據(jù)，計算均值、標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)。與廠家聲明的批內(nèi)精密度進(jìn)行比較，做出判斷。依據(jù) CNAS-CL02-A009:2018《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》[3]，以PT/EPA評價界限(靶值±0.4對數(shù)值)作為允許總誤差(TEa)，要求批內(nèi)精密度小于3/5 TEa，批間精密度小于4/5 TEa。

1.3.3 正確度評價 檢測衛(wèi)生部臨檢中心2017年提供的室間質(zhì)評樣本，檢測結(jié)果與已知靶值和可接受限進(jìn)行比對。項目能力驗證成績≥80%，則判定通過。

1.3.4 檢出限驗證 根據(jù)EP6-A文件[5]，將中山達(dá)安乙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒提供的2.00×103濃度標(biāo)準(zhǔn)品(試劑批號：2017001)用陰性血清進(jìn)行梯度稀釋，濃度分別為1000、100、50、30、15、10、5、2.5 U/ml。ABI Quantistudio Dx實時定量PCR儀對每份樣本進(jìn)行重復(fù)檢測10次。然后，計算CV%, 以檢出率為100%的濃度定為檢出限。

1.3.5 線性范圍評價 根據(jù) EP6-A 文件[5]，用陰性血清將患者血清(濃度為3.00×108U/ml)梯度稀釋，樣本終濃度為1.00×108、1.00×107、1.00×106、1.00×105、1.00×104、1.00×103、1.00×102U/ml，樣本在當(dāng)天完成全部檢測。每個濃度樣本重復(fù)測定3次，檢查數(shù)據(jù)有無離群值。根據(jù)檢測結(jié)果得出線性回歸方程，計算線性相關(guān)系數(shù)，進(jìn)行線性范圍驗證。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0 軟件計算其均值、標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)，所有 HBV-DNA 濃度數(shù)據(jù)均轉(zhuǎn)化為對數(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 精密度驗證結(jié)果 待驗證的樣本與室內(nèi)質(zhì)控品以及標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行DNA提取及HBV DNA的定量擴(kuò)增，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及計算。按照CNAS-CL02-A009:2018醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明附件A.2說明，以PT/EPA評價界限(靶值±0.4對數(shù)值)作為允許總誤差(TEa)，要求批內(nèi)精密度小于3/5 TEa，批間精密度小于4/5 TEa。從表1中可以看出，精密度驗證結(jié)果符合相關(guān)要求，結(jié)果通過。而且，廠家聲明的批內(nèi)及批間的檢測濃度對數(shù)值的CV小于5%，本次結(jié)果在其范圍之內(nèi)。

表1 實時定量PCR儀精密度結(jié)果

2.2 正確度結(jié)果 利用ABI Quantistudio Dx 實時定量PCR儀檢測2017年衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質(zhì)評樣本5例。從表2可以看出，陽性標(biāo)本檢測結(jié)果，均在評價允許范圍內(nèi)。其中最大的偏倚為-7.10%。室間質(zhì)評PT成績100分，測量準(zhǔn)確。

表2 2017年衛(wèi)生部臨檢中心實時定量PCR儀HBV-DNA定量室間質(zhì)評結(jié)果

2.3 檢出限驗證結(jié)果 評價濃度為1000、100、50、30 、15 、10 、5 、2.5 U/ml的樣本的檢出情況。結(jié)果顯示，檢出率分別為100%、100%、100%、60%、20%、0%、0%、0%。再計算各濃度樣本的總CV%。檢出率100%對應(yīng)濃度樣本的CV%都小于5%。根據(jù)廠家聲明，以檢出率為100%的濃度作為檢出限。由此可以看出，本系統(tǒng)的檢出限為50 U/ml。

2.4 線性范圍驗證結(jié)果 本研究選取的患者標(biāo)本，其濃度為3.00×108U/ml。將該濃度進(jìn)行10倍梯度稀釋，最終濃度分別為1.00×108、1.00×107、1.00×106、1.00×105、1.00×104、1.00×103、1.00×102U/ml。檢測結(jié)果以對應(yīng)標(biāo)本濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行相關(guān)線性回歸分析。相關(guān)系數(shù)R2=0.99794，方程為Y=-3.54050X+35.20098(圖1)。進(jìn)一步以標(biāo)本濃度的期望對數(shù)值為橫坐標(biāo)，實測對數(shù)值為縱坐標(biāo)，做線性回歸分析(圖2)，Y=1.0001X，R2=0.9976線性關(guān)系符合要求，線性范圍為1×102～1×108U/ml。符合廠家聲明的線性范圍。

圖1 實時定量PCR儀檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 實時定量PCR儀檢測線性范圍驗證回歸曲線

3 討 論

臨床基因擴(kuò)增實驗室檢測項目操作步驟繁瑣，包括標(biāo)本處理、核酸提取及基因擴(kuò)增，與臨檢、生化及免疫項目檢測步驟相比，自動化程度較低，且不同的操作人員及實驗室硬件條件都會影響檢測結(jié)果。因此，性能驗證是基因檢測實驗室欠缺和亟待提高的重要內(nèi)容。對于一些自建檢測系統(tǒng)，應(yīng)有方法學(xué)驗證過程[6]。

HBV-DNA實時定量PCR檢測所用儀器及檢測試劑種類較多。有學(xué)者研究羅氏、美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司及安捷倫等公司生產(chǎn)的實時定量PCR儀的性能驗證[7-9]。盡管文獻(xiàn)[10-12]報道了美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的7300、7500及ViiA7等型號的性能驗證。然而，迄今為止，國內(nèi)外尚無ABI Quantistudio Dx儀器性能驗證的研究。本研究依據(jù)NCCLS頒布的EP文件，對ABI Quantistudio Dx實時熒光定量 PCR 儀 HBV-DNA 檢測系統(tǒng)進(jìn)行性能驗證，有助于完善本實驗室臨床基因擴(kuò)增的質(zhì)量控制體系。

本研究依據(jù)CLIS EP15-A2文件的有關(guān)方法進(jìn)行精密度評價。結(jié)果表明，高濃度(1.00×106U/ml)和低濃度(1.00×104U/ml)樣本的批內(nèi)精密度CV分別為1.3%和2.09%，批間精密度分別為2.88%和3.92%，均低于廠家聲明的5%。精密度實驗反映檢測結(jié)果的重復(fù)性和一致性。由于本次操作系作者全程參與，人員比較固定，操作熟練，精密度可得到保證。

正確度性能評價主要有兩種方法：(1)實驗方法與參考方法進(jìn)行比對；(2)使用參考物質(zhì)。由于大多數(shù)PCR檢測項目尚無比較公認(rèn)的實驗方法。本研究使用2017年衛(wèi)生部臨床檢驗中心室間質(zhì)評樣本進(jìn)行檢測，最終室間質(zhì)評PT成績100分，結(jié)果合格。說明該儀器測量準(zhǔn)確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HBV-DNA濃度≥50 U/ml時，Quantistudio Dx實時熒光定量 PCR 儀陽性檢測率均為100%。當(dāng)濃度為30 IU/ml時，陽性檢測率為60%。然而，廠家聲明的檢出限為30 U/ml。我們推測，可能與標(biāo)本的基質(zhì)效應(yīng)及實驗過程中的隨機(jī)誤差有關(guān)。

本研究利用不同濃度的樣本進(jìn)行線性范圍驗證，線性回歸方程為Y=1.0001X，截距為0。相關(guān)系數(shù)R2=0.9976。由此可以認(rèn)為，該檢測系統(tǒng)線性范圍良好。楊佳佳等[13]認(rèn)為，當(dāng)血紅蛋白濃度≤28 g/dl、總膽紅素濃度≤30 mg/dl、三酰甘油濃度≤3200 mg/dl時，HBV-DNA檢測結(jié)果不受明顯干擾。我們前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重脂濁時PCR檢測結(jié)果偏低[14]。因此，未來研究應(yīng)增加抗干擾能力測定。因此，建立檢測系統(tǒng)性能驗證的規(guī)范化文件，熟悉定量檢測系統(tǒng)性能驗證內(nèi)容[15]，制定相關(guān)方案，以保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

總之，本研究對ABI Quantistudio Dx實時熒光定量 PCR 儀 HBV-DNA 檢測系統(tǒng)精密度與準(zhǔn)確度良好、檢測線性范圍寬，符合臨床實驗室質(zhì)量管理要求。本研究驗證結(jié)果與廠家聲明一致，可用于臨床標(biāo)本檢測。