李竺娟,寇 煒△,朱琳菊,孫少伯,馬桂蘭

(1.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730030；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合系，蘭州 730000)

作為常規(guī)化療藥物的順鉑在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞及免疫系統(tǒng)也會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，其中腎毒性為其主要的不良反應(yīng)[1]。許多研究證實(shí)一些中藥成分發(fā)揮著提高機(jī)體免疫、保護(hù)細(xì)胞的作用，因此，推測(cè)當(dāng)歸、紅芪等中藥材某些成分可能對(duì)機(jī)體細(xì)胞起到一定保護(hù)作用。在腫瘤化療過(guò)程中輔以當(dāng)歸紅芪超濾物(RAS-RH)以達(dá)到對(duì)化療藥物產(chǎn)生減毒的效果，以保護(hù)正常細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)借助大鼠腎足細(xì)胞，采用順鉑常規(guī)化療，輔以超濾技術(shù)提取純化的RAS-RH干預(yù)，闡明RAS-RH通過(guò)調(diào)控腎足細(xì)胞凋亡的作用減輕腎毒性，為當(dāng)歸、紅芪抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 大鼠腎足細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.1.2藥物 中藥紅芪、當(dāng)歸均采自甘肅省岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定：紅芪是豆科巖黃芪屬植物多序黃芪的干燥根莖，當(dāng)歸為傘形科植物的干燥根，RAS-RH參照本研究小組前期制作流程和結(jié)果，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心與甘肅省膜科學(xué)研究院聯(lián)合制備。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察不同分組腎足細(xì)胞的生長(zhǎng)的代表圖

1.1.3試劑及儀器 倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)；Thermo 311 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；電動(dòng)離心機(jī)(金壇市恒豐儀器廠)；SCS-24搖床(上海市離心機(jī)械研究所)；精密電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；高糖培養(yǎng)基、0.5%胰蛋白酶、TrizonX-100、胎牛血清、100×青霉素-鏈霉素溶液均為美國(guó)HyClone公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)、流式細(xì)胞儀、E-Plate 16孔細(xì)胞檢測(cè)板、xCELLigence RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞功能分析儀(艾森生物-杭州有限公司)；順鉑(6J014A89)上海譜振生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1RAS-RH的制備 當(dāng)歸、紅芪飲片以1∶5的比例混合，水煎煮兩次，過(guò)濾水煎液并加熱濃縮后，陶瓷膜微濾濃縮液(技術(shù)參數(shù)為壓力0.2 mPa/m3、溫度25 ℃，流量10 L·h-1·m-2)，選用截留相對(duì)分子量為1×105PNA中空纖維超濾膜，超濾經(jīng)微濾處理后的當(dāng)歸、紅芪水煎劑濃縮液(技術(shù)參數(shù)：壓力5～6 kg/m3、溫度25 ℃，流量10 L·h-1·m-2)，將超濾液噴霧干燥成粉，相對(duì)生藥材的得率為0.9%[2]。

1.2.2細(xì)胞分組及處理 將大鼠腎足細(xì)胞分成4組：對(duì)照組、藥物組、順鉑組及聯(lián)合組。順鉑組一次性給順鉑4 μg/mL處理24 h，藥物組給予RAS-RH 10 μg/mL培養(yǎng)24 h，聯(lián)合組先給予RAS-RH 10 μg/mL培養(yǎng)24 h，再一次性給予順鉑4 μg/mL處理。

1.2.3RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析 檢測(cè)板前4孔加入150 μL高糖培養(yǎng)基，后4孔加入150 μL RAS-RH，放入RTCA Station中測(cè)定基線，保證每孔接觸正常并且細(xì)胞指數(shù)在正常值之內(nèi)。取制備好的大鼠腎足細(xì)胞懸液，分別以每孔4×103個(gè)接種于檢測(cè)板E-Plate 16中，在超凈臺(tái)中靜置30 min后，置于培養(yǎng)箱中的RTCA工作站中，每隔15 min記錄細(xì)胞指數(shù)，總時(shí)長(zhǎng)96 h。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，在染色緩沖液中5×105個(gè)/mL重懸細(xì)胞，吸取100 μL細(xì)胞(1×105)至試管中，加入5 μL熒光標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)試劑和3 μL碘化丙啶(PI)，混勻后避光室溫孵育15 min，孵育后加入400 μL染色緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1順鉑對(duì)大鼠腎足細(xì)胞增殖的抑制作用 順鉑組腎足細(xì)胞經(jīng)過(guò)順鉑4 μg/mL處理 24 h后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，聯(lián)合組腎足細(xì)胞的生長(zhǎng)要明顯好于順鉑組，見(jiàn)圖1。RTCA分析顯示，順鉑對(duì)腎足細(xì)胞具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用，其抑制程度在一定時(shí)間(72 h)隨著作用時(shí)間增加而增強(qiáng)，聯(lián)合組腎足細(xì)胞的生長(zhǎng)要好于順鉑組(P<0.05)，順鉑處理腎足細(xì)胞的半數(shù)致死濃度(IC50)值為5.30 μg/mL，24 h后達(dá)到最大抑制率，見(jiàn)圖2。

圖2 利用RTCA 實(shí)時(shí)分析不同分組腎足細(xì)胞的生長(zhǎng)

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)RAS-RH對(duì)腎足細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：藥物組[(6.24±0.35)%]與對(duì)照組[(2.68±0.11)%]的凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.093)。順鉑組[(25.80±2.94)%]與對(duì)照組[(2.68±0.11)%]、藥物組[(6.24±0.35)%]、聯(lián)合組[(10.98±1.84)%]的凋亡率兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同分組凋亡率的代表圖

3 討 論

《中國(guó)藥典》載當(dāng)歸為傘形科植物的干燥根，具有“補(bǔ)血、活血、調(diào)經(jīng)止痛”等功效[3]。研究表明，當(dāng)歸所含的生物活性物質(zhì)主要是揮發(fā)性與非揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)，而產(chǎn)生效應(yīng)的主要有揮發(fā)油、藁苯內(nèi)酯、阿魏酸、多糖等成分[4]。紅芪為豆科巖黃芪屬植物，《中國(guó)藥典》收載的常用中藥紅芪為多序巖黃芪的根，紅芪入藥史載于南北朝梁-陶弘景著的《本草經(jīng)集注》，具有“扶正祛邪，益氣固本”的功效[3]。紅芪含有多糖、生物堿、黃酮、氨基酸等物質(zhì)，且多糖為紅芪中最主要的活性成分，是一種雜多糖，具有抗氧化、抗癌、提高機(jī)體免疫力等作用[5]。寇寧等[6]研究表明，紅芪多糖具有較強(qiáng)的清除羥自由基、超氧陰離子自由基及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基等作用。近年來(lái)一些研究證明，RAS-RH中，紅芪補(bǔ)血，當(dāng)歸養(yǎng)血，兩藥合用共奏補(bǔ)氣生血之功，使血?dú)馔?，腎精髓海充足[7]。研究發(fā)現(xiàn)，紅芪多糖能明顯抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，可通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫能力抗癌，還能在體外致使腫瘤細(xì)胞周期停滯、誘導(dǎo)部分腫瘤細(xì)胞凋亡、對(duì)化療藥物起減毒增敏效果等[8]。王小軍等[9]利用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法和流式細(xì)胞術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，紅芪多糖-1可促進(jìn)人肺腺癌A549細(xì)胞活性氧自由基(ROS)、丙二醛(MDA)的上調(diào)，同時(shí)促進(jìn)谷胱甘肽(GSH)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)的下調(diào)，不同劑量紅芪多糖-1均具有抗腫瘤活性的作用，提示其抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡可能與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化機(jī)制平衡有關(guān)。劉華等[10]通過(guò)流式細(xì)胞儀及RT-PCR法研究紅芪多糖誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡與Bax/Bcl-2表達(dá)，觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度的紅芪多糖均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，均可降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，相應(yīng)提高Bax蛋白的表達(dá)，且呈濃度依賴(lài)性，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。張艷霞等[11]采用MTT比色法檢測(cè)當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SPC-A-1細(xì)胞凋亡及周期;吖啶橙/溴化乙啶(AO/BE)雙熒光染色法觀察SPC-A-1細(xì)胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸揮發(fā)油可誘導(dǎo)SPC-A-1細(xì)胞凋亡，推斷出當(dāng)歸揮發(fā)油可能通過(guò)阻滯細(xì)胞于G2期，從而起到抑制SPC-A-1細(xì)胞增殖的作用。安靜等[12]實(shí)驗(yàn)采用AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型，探究當(dāng)歸多糖、當(dāng)歸油對(duì)腫瘤的預(yù)防作用，結(jié)果表明此兩種當(dāng)歸提取物單獨(dú)使用時(shí)均具有降低腫瘤發(fā)病率及抑制腫瘤發(fā)展的作用，且兩者具有協(xié)同作用，以當(dāng)歸油與高劑量的當(dāng)歸多糖配伍對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展抑制作用最強(qiáng)。

順鉑作為主要抗腫瘤藥物，在臨床上被廣泛利用，但其在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)亦損傷正常細(xì)胞，且伴有嚴(yán)重的腎毒性[13]，成為順鉑化療在臨床上應(yīng)用的瓶頸。腎小球足細(xì)胞的濾過(guò)功能是腎臟生理功能的基礎(chǔ)，足細(xì)胞病變是導(dǎo)致慢性腎小球腎炎濾過(guò)功能損傷的決定因素[14]。順鉑可導(dǎo)致DNA物理結(jié)構(gòu)的損傷，而這些損傷能被細(xì)胞內(nèi)的損傷識(shí)別蛋白所識(shí)別，從而啟動(dòng)包括蛋白激酶、c-abl和p53在內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這些途徑一經(jīng)啟動(dòng)都可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。

本研究采用倒置相差顯微鏡和RTCA 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析觀察發(fā)現(xiàn)順鉑對(duì)大鼠腎足細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，而RAS-RH可以對(duì)順鉑導(dǎo)致的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用；同時(shí)RTCA觀察細(xì)胞增殖抑制的動(dòng)態(tài)改變，流式細(xì)胞儀檢測(cè)順鉑組[(25.80±2.94)%]的凋亡率要明顯高于對(duì)照組[(2.68±0.11)%]、藥物組[(6.24±0.35)%]、聯(lián)合組[(10.98±1.84)%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明RAS-RH可以降低順鉑誘導(dǎo)的凋亡率。

綜上所述，RAS-RH對(duì)順鉑誘導(dǎo)的大鼠腎足細(xì)胞損傷作用具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是RAS-RH通過(guò)下調(diào)大鼠腎足細(xì)胞的凋亡率而實(shí)現(xiàn)，但RAS-RH 如何具體影響凋亡細(xì)胞的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。