張克賢，孫勇民，黃艷玲，張軼斌

(天津現(xiàn)代職業(yè)技術學院 天津300350)

光電二極管陣列檢測器是高效液相色譜近年來發(fā)展的新技術，它的開發(fā)和應用使得高效液相色譜技術不僅能夠進行分離定量，而且具備光譜掃描、波長選擇、獲得色譜和光譜的三維譜圖、定性以及色譜峰純度判斷等功能。

光電二極管陣列檢測器的工作原理是用一組光電二極管同時檢測透過樣品的所有波長紫外光和可見光，與普通的紫外檢測器不同的是，進入流動池的光不再是單色光。光源經(jīng)一系列光學反射鏡進入流動池，從流動池出來的光再經(jīng)分光系統(tǒng)、狹縫照射到二極管陣列裝置上，數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)實時記錄下組分的光譜吸收，從而獲得特定組分的結構信息，得到色譜保留時間、光譜波長和峰強度值的三維的立體譜圖。因此，在結果中既可以察看各波長下的色譜圖又可以察看各保留時間下的光譜圖。光電二極管陣列檢測器-高效液相色譜技術在食品、藥品和農(nóng)藥殘留等分析中應用廣泛，如：利用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法分析飲料和蜜柚中維生素C 和光譜定性，測定食品添加劑苯甲酸含量，檢測柑橘果汁中12 種多甲氧基黃酮、類黃酮物質(zhì)等。

本文用光電二極管陣列檢測器-高效液相色譜儀分析純桔汁的類黃酮成分并定性和定量，利用光電二極管陣列檢測器技術，對純桔汁進行光譜掃描、波長選擇，獲得色譜和光譜的三維譜圖并進行色譜峰純度判斷，定性類黃酮中的橙皮苷并以純桔汁的橙皮苷為基準峰定量規(guī)定含桔汁飲料的桔汁含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

LC-20AD 型島津高效液相色譜儀，帶有Prominence SPD-M20A 型二極管陣列檢測器，SIL-20A 型自動進樣器，Prominence LC-20AD 型泵2 臺，CTO-20A 型柱溫箱，島津技邇(上海)商貿(mào)公司W(wǎng)ondaSil C18 Superb(250 mm×4.6 mm，5 μm)反相色譜柱和LabSolutions Essentia 工作站。濟南清川儀器有限有公司流動相過濾裝置(QC-01 型真空泵和玻璃濾瓶一套)，0.22 μm 水型和溶劑型濾膜。江蘇省昆山市超生儀器有限公司KQ-100VDV 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器。針筒式濾膜過濾器[0.22 μm(水系)和0.22 μm(有機系)]和5～10 mL 注射器。德國艾本德公司5804R 型高速離心機。

島津SPD-M20A 具有512 個光電二極管，光源為氘燈+鎢燈，光譜帶寬為1.2 nm(高分辨方式，8 nm高靈敏度方式)，波長準確度為±1 nm，波長精密度為±0.1 nm，檢測波長范圍190～800 nm。通過PDA數(shù)據(jù)可以建立一次進樣純化中適合多個不同吸收特性的樣品制備分離方法。

1.2 試劑和材料

橙皮苷(純度96.2%，中國食品藥品檢定研究院)，乙腈(HPLC 色譜純，天津市起連興化學品有限公司)，冰乙酸(HPLC 色譜純，天津市起連興化學品有限公司)，甲醇(HPLC 色譜純，天津市起連興化學品有限公司)，純鮮榨桔汁(天津山海關飲料有限公司提供)，實驗用水為經(jīng)過Milli-Q Adwantage A10 型超純水機過濾后的超純水。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

利用同一批次純鮮榨桔汁由天津山海關飲料有限公司制備濃度為3%、5%、7%、10%、20%的碳酸型桔汁飲料，然后將該純鮮榨桔汁用超純水配成10%～80%樣品(純鮮榨桔汁配制前振蕩、搖勻，保證桔汁均勻一致再進行配制)，分別移取上述樣品25 mL 于50 mL 容量瓶中用乙腈定容成50 mL，同樣配制純鮮榨桔汁。將樣品和溶劑配伍后經(jīng)超聲脫氣，再分別移取6～7 mL 于10 mL 離心試管中，離心5 min 后取上層清液，經(jīng)0.22 μm 針筒式濾膜過濾器過濾，備用。

1.3.2 標準溶液的配制

用精度0.1 mg 的電子天平稱取橙皮苷標準品0.025 6 g置于50.00 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并定容。如果溶解中較困難需用超聲波進行超聲溶解后再定容。該定容物為500 mg/L 的新橙皮苷儲備液，根據(jù)標準曲線需要逐級稀釋成不同濃度的使用液。

1.3.3 儀器條件確定

優(yōu)化后的色譜條件為：以島津技邇(上海)商貿(mào)公司W(wǎng)ondaSil C18 Superb(250 mm×4.6 mm，5 μm)反相色譜柱為分析柱，0.2%乙酸水溶液和乙腈作為流動相，流速為1.0 mL/min，進樣30 μL，梯度洗脫(洗脫程序見表1)，柱溫40 ℃，DAD 檢測器在190～800 nm 檢測橙皮苷化合物。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure for mobile phase

1.3.4 純鮮榨桔汁和橙皮苷標準品的三維譜圖

將樣品制備純鮮榨桔汁和橙皮苷標準品的儲備液按照流動相梯度洗脫程序進行二極管陣列檢測器-高效液相色譜分析，通過3D 視圖得到它們的色譜保留時間、光譜波長和峰強度值的三維立體譜圖(見圖1 和圖2)。二極管陣列檢測器-高效液相色譜可以提供全波長的色譜圖，包括單波長色譜圖、任意2 個波長的吸收比色譜圖、波長時間程序色譜圖、最大吸收波長色譜圖以及總體吸收色譜圖，其中最大吸收波長色譜圖為靈敏度最高的檢測方式，而總體吸收色譜圖為定量重復性最好的方法。

圖1 橙皮苷標準品的色譜、光譜三維譜圖Fig.1 Chromatogram and three-dimensional spectrum of hesperidin standard

圖2 純鮮榨桔汁的色譜、光譜三維譜圖Fig.2 Chromatogram and three-dimensional spectrum of pure fresh orange juice

1.3.5 純鮮榨桔汁和橙皮苷標準品的色譜圖

將純鮮榨桔汁和橙皮苷標準品的儲備液按照流動相梯度洗脫程序進行二極管陣列檢測器-高效液相色譜分析，同時得到的色譜圖在波長190～800 nm 范圍任一波長條件下均進行了色譜數(shù)據(jù)采集，當需要某一波長色譜圖時，輸入波長即可顯示該波長條件下的色譜圖。圖3 和圖4 為某波長的色譜圖。

圖3 某一波長的純鮮榨桔汁的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of pure fresh orange juice at a wavelenth

圖4 某一波長的橙皮苷標準品的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of hesperidin standard at a wavelength

1.3.6 純鮮榨桔汁和橙皮苷標準品的光譜視圖

二極管陣列檢測器進行數(shù)據(jù)采集時，采集色譜分離鋒的同時進行光譜波長190～800 nm 范圍的掃描并記錄數(shù)據(jù)，獲得光譜視圖見圖5 和圖6(圖5 為橙皮苷標準品光譜視圖，圖6 為純鮮榨桔汁中橙皮苷峰的光譜視圖)。因為類黃酮在紫外波長范圍有吸收，而可見光部分沒有吸收，所以截取光譜視圖波長區(qū)間為190～400 nm。

圖5 橙皮苷標準品光譜視圖Fig.5 Spectroscopic view of hesperidin standard

圖6 純鮮榨桔汁中橙皮苷峰的光譜視圖Fig.6 Spectroscopic view of hesperidin in pure fresh orange juice

2 結果與分析

2.1 標樣橙皮苷波長的選擇

普通紫外檢測器液相條件的波長選擇通過紫外分光光度計掃描選擇最大吸收波長后，將該吸收波長設定紫外檢測器進行HPLC 分析測試，其中的缺陷是這個最大吸收波長為混合組分的最大吸收波長，而二極管陣列檢測器液相可以分別對各個峰或各個組分進行最大吸收波長的選擇。例如圖5 和圖6：圖5為橙皮苷標準品光譜視圖，圖6 為純鮮榨桔汁中橙皮苷峰的光譜視圖，其最大吸收波長均為283 nm。選擇最大吸收波長達到可以進行靈敏度最高的檢測，因此二極管陣列檢測器-高效液相色譜不僅包括了所有紫外檢測器液相色譜儀的功能，還可完全代替紫外檢測器進行HPLC 分析。

另外，通過記錄不同吸收波長色譜圖并平鋪譜圖，記錄選定峰的強度值與吸收波長對應便可以得到該峰的最大吸收波長，見圖7、表2 和圖8。圖7 為不同吸收波長色譜圖并多譜圖排列，顯示保留時間、波長和峰的強度值等信息；表2 記錄波長與峰強度的對應數(shù)值；圖8 為波長與峰強度值散點示意圖。

圖7 橙皮苷標準品不同波長的色譜圖Fig.7 Chromatogram of hesperidin standard at different wavelengths

表2 不同波長檢測出色譜圖對應的強度值Tab.2 Different wavelengths to detect the corresponding intensity values of excellent spectra

圖8 橙皮苷標準品波長與峰強度值散點示意圖Fig.8 Sketch map of dispersion of hesperidin standard wavelength and peak intensity

2.2 鮮榨桔汁中橙皮苷成分定性

將經(jīng)過離心、超聲脫氣和過濾好的鮮榨桔汁和乙腈混合物(體積比為1∶1)，轉移到自動進樣器樣品瓶中，同樣制備新橙皮苷儲備液轉移到自動進樣器樣品瓶中，按照上述色譜條件進行色譜分析。桔汁中橙皮苷定性采用保留時間和樣品中加入橙皮苷標準物后某一峰增高的方法完成，見圖3、圖4 和圖9。圖3鮮榨桔汁與圖 4 中橙皮苷標準品保留時間約17.7 min 相對應；圖9 中加入橙皮苷內(nèi)標物該峰明顯增高，說明該峰為樣品中橙皮苷成分。

圖9 鮮榨桔汁加入橙皮苷標準品的色譜圖Fig.9 Chromatogram of standard orange juice added hesperidin standard

2.3 鮮榨桔汁中橙皮苷色譜峰純度判斷

紫外檢測器液相不能進行色譜峰純度判斷，而二極管陣列檢測器液相可以進行色譜峰純度判斷，見圖10 和圖11。純度視圖中峰純度閾值達到該峰純度要求，不受噪音影響，峰輪廓圖也無噪音影響。

2.4 標準曲線的繪制

將橙皮苷儲備液進行不同濃度梯度稀釋，配制5、10、15、20 mg/L 的標準使用液并進行過濾，在相同儀器條件下進行色譜分析，以橙皮苷標準品濃度為橫坐標，以濃度對應峰面曲積為縱坐標作標準曲線(圖12)，得到回歸方程：y＝32 473x，回歸系數(shù)為0.998 2。未知樣經(jīng)過色譜分析，通過峰面積利用該標準線即可求出濃度。

圖10 橙皮苷標準品的峰純度圖Fig.10 Peak purity map of hesperidin standard

圖11 橙皮苷標準品的峰輪廓圖Fig.11 Peak profile of hesperidin standard

圖12 橙皮苷標準曲線Fig.12 Standard curve of hesperidin

2.5 桔汁含量計算

原桔汁純品在相同儀器條件下進行色譜分析，得到原果汁純品的橙皮苷HPLC 峰面積，記為S純，根據(jù)標準曲線計算出原果汁中的橙皮苷含量C純。利用同一批次原果汁純品配制的不同濃度的桔汁樣品，進行相同條件分析，分別得到各個不同濃度桔汁樣品的HPLC 峰面積，同樣分別計算橙皮苷濃度。

以稀釋樣橙皮苷濃度除以純樣橙皮苷濃度得到配制橙汁含量，計算公式如下：

式中：Xi為桔汁含量，%；Pi為稀橙皮苷含量，mg/L；P純?yōu)榧儤有鲁绕ぼ蘸?，mg/L；Si為稀釋樣新橙皮苷HPLC 峰面積；Si純?yōu)榧儤映绕ぼ誋PLC 峰面積(當測定中使用同一橙皮苷標準曲線時可以簡化算式用橙皮苷HPLC 峰面積直接計算)。

2.6 不同含量桔汁及桔汁飲料測定結果及其與國標法對比

根據(jù)國標GB/T 12143—2008 方法，檢測了天津山海關飲料有限公司制備的濃度為3%、5%、7%、10%、20%的碳酸型桔汁飲料和該純鮮榨桔汁用超純水配成的10%～80%樣品中可溶性固形物、鉀、總磷、氨基酸態(tài)氮、L-脯氨酸、總D-異檸檬酸和總黃酮7 項指標，并依據(jù)后6 種組分的標準值和權值綜合計算桔汁添加量，同時用二極管陣列檢測器液相色譜法檢測了上述樣品的桔汁含量，并與國標法檢測結果進行對比。最終確定以橙皮苷作為快速檢測的基準物，相對誤差控制在1%范圍內(nèi)，空白加標回收率在98%～103%之間，相對標準偏差在1%～3%之間，相對誤差在1%～5%之間(表3)。國標法在相對誤差3%～8%之間(表4)。

表3 不同濃度的桔汁樣品測定回收率試驗結果Tab.3 Test results of recovery rate of orange juice samples with different concentrations

表4 國標方法與本方法檢測桔汁含量比較Tab.4 Comparison of national standard method and this method for orange juice content determination

3 結 論

光電二極管陣列檢測器高效液相色譜法具有溶劑使用量少、凈化效果好、操作簡便、快速等特點，可用于純鮮榨桔汁及其制品的桔汁含量的測定；與國標方法相比較，樣品處理簡單只需經(jīng)離心、過濾即可檢測，整個檢測過程時間有較大縮短。

本方法選擇桔汁中類黃酮成分之一橙皮苷作定量基準峰，測定結果精密度較好，回收率為98%～103%之間，相對標準偏差(RSD)為1%～3%之間；與國標法結果對比相對誤差較小，滿足分析純鮮榨桔汁及其制品的桔汁含量的測定的要求。