王 靜，彭 雙，胡 圣，卓 維，陳 倩，李立芹，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.作物科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，四川 成都 611130)

質(zhì)膜ATPase是植物細(xì)胞膜上非常重要的功能蛋白，被認(rèn)為是植物細(xì)胞代謝和生命活動過程的主宰酶[1]。ATPase在細(xì)胞質(zhì)膜上產(chǎn)生質(zhì)子梯度，在植物生長發(fā)育中調(diào)節(jié)著許多生理過程[2]。根據(jù)位置及功能不同，植物細(xì)胞內(nèi)的ATPase可分為F、P和V三大類型，其中F型ATPase主要分布在線粒體和葉綠體上，P型ATPase分布在質(zhì)膜上，V型ATPase分布在液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體、高爾基體膜上[3]。ATPase在植物生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期以及脅迫響應(yīng)等多種生理過程中行使重要功能[4]。近年來，關(guān)于植物ATPase基因的鑒定和功能研究取得了較大進(jìn)展，ATPase由大約10個(gè)基因的家族編碼[5]。Ayala等[6]研究表明，鹽角草在200 mmol·L-1NaCl處理下，質(zhì)膜ATPase活性增加。Binzel[7]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下，番茄質(zhì)膜ATPase蛋白表達(dá)量增加。也有研究表明，鹽芥幼苗根、葉質(zhì)膜ATPase活性在100～400 mmol·L-1NaCl處理下較對照均有不同程度的提高[8]。構(gòu)樹幼苗在100 μmol·L-1NaCl處理下，質(zhì)膜ATPase活性達(dá)到最大值，在150 μmol·L-1NaCl處理下質(zhì)膜ATPase活性有所降低，但均高于對照[9]。

煙草是我國非常重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，而冷害、干旱、鹽堿等非生物環(huán)境脅迫嚴(yán)重阻礙了煙草的產(chǎn)量與品質(zhì)[10]。植物細(xì)胞中，質(zhì)膜ATPase在細(xì)胞生長發(fā)育以及抗逆境脅迫中起著重要的作用[11]。越來越多的質(zhì)膜ATPase基因被克隆，但煙草中編碼質(zhì)膜ATPase4蛋白的基因尚未報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)從煙草中克隆一個(gè)質(zhì)膜ATPase4基因，運(yùn)用生物信息學(xué)方法，預(yù)測ATPase4基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)，分析該基因在煙草根、莖、葉、花等不同組織中的表達(dá)水平以及在低鉀、PEG、高鹽、冷脅迫等逆境下的表達(dá)模式，并成功構(gòu)建ATPase4-pcambia1300過表達(dá)載體，以期為進(jìn)一步研究煙草ATPase4基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

本實(shí)驗(yàn)使用的普通煙草品種為K326。大腸埃希菌感受態(tài)DH5α購自VazymeBiotech公司，Trizol試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真R045A酶、SYBR Green Master mix、DNA Ligation Kit 2.0等試劑購自TaKaRa，引物合成與測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理

挑選籽粒飽滿、大小一致的煙草種子用75%乙醇消毒1 min，然后20%次氯酸鈉溶液消毒20 min，用無菌水反復(fù)清洗5～6次，在超凈工作臺內(nèi)播種于MS培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上播種3排30粒左右，放置在16 h/8 h(光/暗)，25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d后，挑取長勢一致的幼苗，在MS培養(yǎng)基上分別加入KCl(10 mmol·L-1)和5% PEG-6000、NaCl(200 mmol·L-1)進(jìn)行低鉀、干旱、高鹽處理，同時(shí)將培養(yǎng)基放入4 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫處理。處理0、3、6、12、24 h進(jìn)行整株取樣。

1.2.2 煙草ATPase4基因的克隆

參考GenBank收錄的絨毛狀煙草ATPase4序列(序列號：XM_016657566.1)，采用同源克隆的方法，用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物全長引物ATPase4-F和ATPase4-R(表1)。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸3 min；35個(gè)循環(huán)。目的片段純化后與pMD19-T載體于16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)。隨后在涂有卡那霉素LB平板上進(jìn)行篩選，菌落PCR檢測篩選陽性克隆，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 煙草ATPase4基因的表達(dá)分析

根據(jù)基因序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量(qRT-PCR)引物，以煙草18S rRNA為內(nèi)參，引物序列為18S-F和18S-R(表1)。所有的樣品都設(shè)置4個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后，基因相對表達(dá)水平用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 構(gòu)建過表達(dá)載體

重組克隆載體ATPase4-pMD19-T與表達(dá)載體pcambia1300用內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ進(jìn)行酶切，酶切體系10 μL，含1 μL 10×T緩沖液，1 μL BSA，1 μLXbaⅠ，1 μLSmaⅠ，4 μLNtHA-pMD19-T/pcambia1300載體，2 μL ddH2O。回收純化目的片段后與pcambia1300載體于16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，隨后在涂有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，菌落PCR檢測篩選陽性克隆，搖菌提取質(zhì)粒，酶切檢測后送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 煙草ATPase4基因生物信息學(xué)分析

利用ExPASyProtParamtoo分析ATPase4編碼蛋白的理化性質(zhì)；DNAMAN軟件分析其編碼蛋白的疏水性；運(yùn)用IBCP的在線工具SOPMA預(yù)測ATPase4二級結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL在線預(yù)測ATPase4的三級結(jié)構(gòu)；SMART在線分析ATPase4基因編碼蛋白氨基酸的結(jié)構(gòu)域；NetPhos3.1 Server對蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析；PSORT預(yù)測ATPase4的亞細(xì)胞定位；Signal-P4.1 Server在線預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽；運(yùn)用MEGA 7軟件，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

提取煙草葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，在接近3 000 bp的位置上有清晰的條帶(圖1)。將該條帶回收純化后與載體pMD19-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)。將鑒定出的陽性克隆隨機(jī)挑選3個(gè)進(jìn)行測序，結(jié)果顯示，3個(gè)測序結(jié)果一致且目的片段大小為2 982 bp。

2.2 ATPase4-pcambia1300過表達(dá)載體的檢測

表1引物序列

Table1Primer sequences

引物名稱引物序列Primer namePrimer sequencesATPase4-FATPase4-RATPase4-qFATPase4-qR18SF18SR5′-ATGGCGGATCAGAAGGGAAC-3′5′-CTAAACCGTGTAATGTTGCT-3′5′-AGGATTCGTGGTATTGGTTGGG-3′5′-CTCTTGGCCTGTTCGGCTATTT-3′5′-CCTACGCTCTGTATACATTAGC-3′5′-GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC-3′

M，Marker 5 000 bp；1，ATPase4基因。M， Marker 5 000 bp; 1， ATPase4 gene.圖1 ATPase4的克隆Fig.1 Cloning of ATPase4

將克隆載體ATPase4-pMD19-T與表達(dá)載體pcambia1300分別進(jìn)行酶切，連接轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)，挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR，篩選構(gòu)建成功的陽性克隆。利用菌落PCR篩選陽性克隆，1～8為陽性克隆，9為陰性對照(圖2)，陽性克隆在3 000 bp處有清晰的條帶，而陰性對照沒有該條帶。挑取構(gòu)建成功的陽性克隆，送上海生物有限公司進(jìn)行測序，測序該目的條帶結(jié)果大小為2 982 bp，證明ATPase4-pcambia1300載體構(gòu)建成功。

2.3 ATPase4基因和蛋白序列分析

2.3.1 ATPase4的理化性質(zhì)及疏水性分析

ATPase4編碼蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明：含有20種氨基酸，丙氨酸Ala(94，9.8%)、精氨酸(94，9.8%)含量最高，而半胱氨酸Cys(7，0.7%)含量最少。蛋白預(yù)測的分子質(zhì)量為105.88 ku，含有963個(gè)核酸殘基，理論等電點(diǎn)pI為6.66，不穩(wěn)定系數(shù)是34.76，該蛋白是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白。運(yùn)用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)進(jìn)行的疏水性分析結(jié)果顯示，該蛋白總的親水性平均指數(shù)為0.136，該蛋白屬于疏水性蛋白(圖3)。

M，Marker 5 000 bp；1～8，ATPase4基因；9，陰性對照。M， Marker 5 000 bp; 1-8， ATPase4 gene PCR product; 9， Negative control.圖2 ATPase4過表達(dá)載體構(gòu)建Fig.2 Construction of ATPase4 overexpression vector

2.3.2 ATPase4的二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

如圖4所示，利用IBCP(https://npsa-prabi.ibcp.fr)在線工具對ATPase4基因編碼蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白中41.12%的氨基酸參與α-螺旋(alpha helix)，21.91%的氨基酸參與延伸鏈(extended strand)，28.56%氨基酸參與無規(guī)則卷曲(random coil)，有8.41%的氨基酸參與β-轉(zhuǎn)角(beta turn)。所以，該蛋白二級結(jié)構(gòu)的最大元件為α-螺旋(alpha helix)。運(yùn)用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對ATPase4的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，用RasTop軟件進(jìn)行顯示，并將結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行對比，兩者結(jié)果一致。

圖3 ATPase4疏水區(qū)預(yù)測Fig.3 Prediction of hydrophobic region of ATPase4

A，二級結(jié)構(gòu)；B，三級結(jié)構(gòu)。A， Secondary structure; B， Tertiary structure.圖4 ATPase4的結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of the structure of ATPase4

2.3.3ATPase4基因編碼蛋白亞細(xì)胞定位及信號肽分析

利用PSORT(http://psort1.hgc.jp/form.html)預(yù)測的ATPase4亞細(xì)胞定位；Signal-P4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測蛋白信號肽。結(jié)果表明，該基因在質(zhì)膜上占0.800，在高爾基體膜占0.400，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上占0.300，在微體(過氧化物酶體)中占0.300，因此，預(yù)測該基因可能定位在質(zhì)膜上。根據(jù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法或隱馬氏模型方法預(yù)測信號肽位置及切割位點(diǎn)，利用mean-score來判斷是否為分泌蛋白(圖5)，預(yù)測結(jié)果顯示score值為0.093，小于0.5，說明該基因編碼的蛋白不是分泌蛋白，所以不存在信號肽。

2.3.4 ATPase4編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

利用NetPhos3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進(jìn)行分析蛋白磷酸化位點(diǎn)，NetPhos3.1是利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測真核細(xì)胞蛋白質(zhì)中絲氨酸(Serine)、蘇氨酸(Threonine)和酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位點(diǎn)工具，NetPhos中的內(nèi)設(shè)閾值為0.5，高于0.5則被認(rèn)為是可能的磷酸化位點(diǎn)。NetPhos對ATPase4基因編碼蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析顯示(圖6)，ATPase4基因編碼蛋白中含有36個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)、23個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)，說明該基因編碼的蛋白能被激酶所磷酸化，進(jìn)而參與逆境脅迫。

圖5 ATPase4的信號肽預(yù)測Fig.5 Prediction of signal peptide of ATPase4

圖6 ATPase4的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.6 Prediction of phosphorylation site of ATPase4

2.3.5 ATPase4同源性分析

將ATPase4氨基酸序列進(jìn)行Blastp序列比對，為進(jìn)一步分析ATPase4蛋白與其他物種內(nèi)質(zhì)膜ATPase家族的蛋白相關(guān)性，將ATPase4氨基酸序列與其他物種進(jìn)行比對(圖7)，結(jié)果顯示，該煙草質(zhì)膜ATPase4蛋白與其他物種質(zhì)膜ATPase4蛋白序列之間具有高度的保守性。采用鄰近法與不同物種做出系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，煙草質(zhì)膜ATPase4氨基酸序列與美花煙草和辣椒質(zhì)膜ATPase4具有較高氨基酸序列相似性，分別為98%、94%；與榴蓮和南瓜質(zhì)膜ATPase4相似性較低，分別為82%和81%(圖8)，同源分析結(jié)果表明，該蛋白與其他物種的質(zhì)膜ATPase4相似。

2.4 ATPase4的組織表達(dá)分析

提取幼苗K326的根、葉、花成熟期的總RNA，進(jìn)行去除DNA基因組，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，通過對ATPase4在各個(gè)組織的表達(dá)量分析(圖9)的結(jié)果表明，ATPase4基因在根中表達(dá)量最高，葉和花中表達(dá)量較低。根中表達(dá)量約為葉的8.9倍，這說明ATPase4基因主要在煙草K326植株的根中表達(dá)。

2.5 ATPase4在逆境脅迫處理下的表達(dá)分析

分別選取經(jīng)KCl(10 mmol·L-1)、5% PEG-6000、NaCl(200 mmol·L-1)以及4 ℃處理后的煙草K326幼苗，對其ATPase4基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在低鉀和鹽處理?xiàng)l件下，ATPase4相對表達(dá)量分別在6和12 h達(dá)到最大值，分別為對照(0 h)的1.73和5.09倍。ATPase4相對表達(dá)量在冷處理下受到抑制，是對照表達(dá)量(0 h)4 ℃處理24 h的1.99倍。這些結(jié)果表明ATPase4能夠被逆境脅迫相關(guān)的信號分子調(diào)控，其表達(dá)量如圖10所示。

圖7 ATPase4蛋白多重序列比對Fig.7 Multiple sequence alignment of ATPase4

圖8 ATPase4蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of ATPase4

不同數(shù)據(jù)間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars without the same lowercase letters showed the significant difference (P<0.05).圖9 不同組織中ATPase4基因的相對表達(dá)量分析Fig.9 Relative expression analysis of ATPase4 in different tissues

同一處理不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)間沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。Under the same treatment at different time， the bars without the same lowercase letters showed significance at the level of 0.05.圖10 ATPase4在逆境脅迫下的表達(dá)分析Fig.10 Relative expression analysis of ATPase4 under abiotic stress

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用同源克隆的方法，從普通煙草K326中克隆的一個(gè)質(zhì)膜ATPase家族成員ATPase4基因。生物信息學(xué)分析表示，ATPase4基因編碼的蛋白具有多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化修飾位點(diǎn)，可能與其調(diào)節(jié)的較多功能相適應(yīng)。質(zhì)膜ATPase分布在質(zhì)膜上，是以兩個(gè)催化亞基的形式存在的，是由一個(gè)多基因家族編碼的酶類，使這些家族不同的成員具有組織和器官的特異性[12]。質(zhì)膜ATPase在進(jìn)化上可以大致分為5個(gè)亞家族，而煙草ATPase基因表達(dá)模式分析證明為第Ⅱ家族，這種表達(dá)模式幾乎在任何組織中都有表達(dá)[11，13]。熒光定量PCR結(jié)果表明，ATPase4基因在根、葉、花中都有表達(dá)，因此推測該基因可能參與了煙草生長的一系列生理反應(yīng)。劉健健等[14]研究表明，質(zhì)膜ATPase家族基因在番茄所有組織中都有表達(dá)，但在果實(shí)中表達(dá)較少。ATPase4基因在根中表達(dá)量最高，而在葉和花中表達(dá)量較低，與番茄質(zhì)膜ATPase4基因在根中表達(dá)量最高相一致[15]。為保證植株正常生長，需從根部吸收更多水分和離子，通過細(xì)胞液中積累無機(jī)離子或合成有機(jī)溶質(zhì)等方式進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)以減輕或避免傷害[16]，推測ATPase4基因在煙草和番茄中可能與根中離子運(yùn)輸有關(guān)。

在轉(zhuǎn)錄水平上，質(zhì)膜ATPase參與了植物生長發(fā)育過程中多種脅迫反應(yīng)[17]。質(zhì)膜ATPase在植物生長、發(fā)育和對外環(huán)境的適應(yīng)過程中的重要作用已有相關(guān)報(bào)道，其中，在鹽脅迫過程中質(zhì)膜ATPase的應(yīng)答功能研究較多[11-15]。qRT-PCR分析結(jié)果表明，煙草ATPase4在低鉀處理6 h時(shí)達(dá)到最大值，之后又下降，因此推測ATPase4基因可能是在低鉀脅迫早期的響應(yīng)基因，能快速響應(yīng)低鉀脅迫，在后期隨著時(shí)間的延長其表達(dá)受到了抑制，可能是因?yàn)橹仓赀m應(yīng)了脅迫。在PEG-6000處理下，ATPase4基因表達(dá)水平在0～24 h內(nèi)逐漸增加。Li等[18]用6% PEG處理大豆種子，質(zhì)膜ATPase活性隨著處理時(shí)間而增強(qiáng)，在12 h活性達(dá)到最大，此后到72 h間活性稍許下降，但仍大于對照。Yang等[19]用6% PEG處理大豆種子，與Li等[18]得出結(jié)論一致。說明ATPase4基因與干旱脅迫相關(guān)，因此推測在PEG處理后基因表達(dá)量上升使質(zhì)膜ATPase活性增強(qiáng)。

經(jīng)鹽處理，ATPase4基因表達(dá)量明顯提高，表達(dá)量12 h達(dá)到最大，與劉尼歌等[20]得出鹽能誘導(dǎo)煙草質(zhì)膜ATPase基因表達(dá)的結(jié)論相一致。Ballesteros等[21]分別用75和150 mmol·L-1NaCl處理向日葵3 d后，提取根的質(zhì)膜微囊，測定質(zhì)膜ATPase的活性，結(jié)果表明，NaCl處理的向日葵根部質(zhì)膜ATPase的活性顯著提高。鹽脅迫條件下，抗鹽品種可能累積較多的mRNA，參與作物的相關(guān)逆境脅迫，進(jìn)而導(dǎo)致植物的代謝水平發(fā)生相應(yīng)的改變[22-24]。

冷處理ATPase4基因表達(dá)量在早期(3 h)沒有明顯變化，在6 h時(shí)約為對照的0.49倍，說明后期冷處理抑制了ATPase4基因表達(dá)。簡令成等[24]研究表明，在5 ℃低溫處理番茄幼苗，12 h后幼苗子葉質(zhì)膜ATPase活性顯著降低。植物在適應(yīng)低溫時(shí)，膜脂從液態(tài)變?yōu)榘虢Y(jié)晶態(tài)，因而影響膜的流動性，使得基因表達(dá)受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)ATP酶活性降低。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATPase4基因在低鉀、干旱、鹽脅迫和冷脅迫下發(fā)揮重要作用，但其編碼的蛋白的具體功能，尚待進(jìn)一步研究。后續(xù)研究將進(jìn)一步獲得轉(zhuǎn)基因煙草以及測定轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)生理指標(biāo)，進(jìn)一步闡明該基因在逆境脅迫中的作用。