劉揚，李亞峰，李宏楊，劉國民

（1.海南大學苦丁茶研究所，海南海口 570228；2.三亞市南繁科學技術研究院，海南三亞 572000）

1 引言

青葙（Celosia argenteaL.）是莧科青葙屬植物，別名草蒿、百日紅、雞冠莧，是一種野生藥食兩用植物。全株無毛；莖直立，有分枝。葉矩圓狀披針形至披針形。穗狀花序長3～10cm；苞片、小苞片和花被片干膜質，光亮，淡紅色。胞果卵形，蓋裂；種子腎狀圓形，黑色，光亮。生長分布幾遍全國，野生或栽培；朝鮮、日本、前蘇聯(lián)地區(qū)、中南半島、菲律賓、非洲也有分布。生于平原或山坡，為旱田雜草[1]。

青葙嫩莖葉和幼苗均可食用,青葙營養(yǎng)豐富，口感清香柔嫩, 是一種可填補蔬菜淡季的天然無公害食品[2]。同時青葙具有止血涼血和清熱解毒功之效，可降血壓、去瘙癢、除白帶，且具有治療眼膜炎和角膜炎，具有預防癌癥和散熱消腫之功效。青葙干燥成熟種子系藥典收載品種，具有清肝明目和退翳之功效?，F(xiàn)代研究表明，青葙子具有保肝、抗糖尿病、抗腫瘤等作用。青葙種子富含必需氨基酸，油脂脂肪酸組成可制備食用調和油有較高營養(yǎng)保健價值[3]。隨著人們需求上升以及藥理藥化研究不斷深入青葙藥用和食用量將越來越大。

植物試管內開花研究已有70 余年歷史，已有過諸多報道，約有35 個科的植物被用于試管內開花研究，其中包括對青葙屬植物雞冠花(Celosia cristataL.)試管內開花有若干研究報道[4～5]。但人們對于青葙的試管內開花則研究很少。該論文系首次報道青葙離體快繁與試管內開花的研究結果。

國外試管花卉研發(fā)比較流行，已形成了一定產業(yè)，但試管花卉之商品種類很少。國外離體花卉的研究重點放在運用分子生物技術對花卉的遺傳基因進行改造方面[6，7]，而國內則重放在利用植物激素對試管花卉植株進行調控[8～10]。該課題的工作主要是探索青葙離體快繁和試管內開花過程所涉及的相關工藝技術和理論問題。其中工藝技術研究內容主要包括：外植體材料表面消毒及初代接種操作，莖段離體快繁的操作方法及適宜的培養(yǎng)基配方，成花培養(yǎng)過程中相關操作方法及適宜的培養(yǎng)基配方，以及開花后保鮮培養(yǎng)的操作方法及相關培養(yǎng)基配方等；理論探討重點主要是解決兩個方面的問題：一是探討ABA 的不同濃度和不同處理時長的預處理中對青葙無菌苗開花百分率的影響；二是研究在成花培養(yǎng)階段同時采用低濃度N 脅迫和高濃度P 脅迫條件對青葙無菌苗開花百分率的影響。試圖通過這些工作為青葙的試管內開花提供植物生理學理論依據(jù)和試管花工藝技術支持。

2 材料與方法

2.1 材料

從云南省普洱市郊區(qū)的野生青葙植株上取種子作為外植體材料。

2.2 方法

2.2.1 外植體材料表面消毒及初代接種操作

將青葙種子置于200ml 三角瓶中，用30 目鋼絲網(wǎng)封口并扎緊，然后置于自來水龍頭下沖洗5h；倒去水后，加入適量5%洗潔精溶液，搖洗5min，透過鋼絲網(wǎng)濾去洗潔精溶液，并用自來水將種子沖洗干凈。如此重復，將種子搖洗3 次，每次5min，最后一次瀝干水備用。

將洗凈的青葙種子轉移到超凈工作臺上，在無菌條件下，先用0.3% KMnO4將種子消毒3h，然后倒去KMnO4消毒液，用無菌水將種子清洗4～5 遍，最后一遍瀝干水，再加入75%乙醇滅菌3min，倒去乙醇滅菌液，再加入0.15% HgCI2滅菌15min；倒去HgCI2溶液，再用無菌水將種子沖洗4～5 遍，最后一遍瀝干水備用。

在超凈工作臺上用無菌的不銹鋼藥品勺的背面粘附經過表面消毒的無菌青箱種子，然后輕輕地將種子敲落在無菌發(fā)芽培養(yǎng)基的表面。每瓶接入5～6粒種子。

2.2.2 培養(yǎng)室的光溫條件

該實驗中的各個培養(yǎng)階段，實驗材料均置于（25±2）℃室溫條件下進行培養(yǎng)，用日光燈照明，光照強度約為2000lx。每天照明10h（8：00～18：00）。

2.2.3 培養(yǎng)基的配制及滅菌方法

該實驗中所采用的各種培養(yǎng)基，均按照植物組織培養(yǎng)中的常規(guī)方法配制和滅菌[11]。

2.2.4 各培養(yǎng)階段所采用的培養(yǎng)基配方及相關操作方法

2.2.4.1 種子無菌發(fā)芽培養(yǎng)階段

MS+肌醇100mg/L+煙酸1.0mg/L+ 鹽酸硫胺素2.0mg/L+ 鹽酸吡哆素1.0mg/L+ 甘氨酸2.0mg/L+蔗糖2.5%+卡拉膠0.7%；pH=5.8。

每瓶接入5～6 粒種子，種子萌發(fā)后，當無菌實生苗長至株高3～4cm 時，在超凈工作臺無菌條件下，將實驗苗轉接到增殖培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，或轉接到附加有ABA 花芽誘導培養(yǎng)基上繼續(xù)進行花芽誘導培養(yǎng)。

2.2.4.2 莖段離體快繁階段

青葙植株的種子量很大，種子個體很小，初代培養(yǎng)時進行表面消毒比較容易成功，污染率較低，種子的發(fā)芽率較高。所以，在花芽誘導階段，材料的來源可以從兩個途徑得以滿足：一是用無菌實生苗，切除并棄去植株基部的的1/3，將中上部轉接到花芽誘導培養(yǎng)基上即可；二是在生產單位或研發(fā)單位所掌握的青葙種子量不多的情況下，可利用少量種子先構建一批無菌材料（無菌實生苗），再將這批無菌實生苗離體快繁若干代，培養(yǎng)出大量叢生芽，然后取叢生芽中上部，轉接到花芽誘導培養(yǎng)基上。

該研究中用于青葙叢生苗增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基如下：

MS+肌醇100mg/L+煙酸1.0mg/L+鹽酸硫胺素2.0mg/L+ 鹽酸吡哆素1.0mg/L+ 甘氨酸2.0mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+ 糖2.5%+ 卡拉膠0.7%；pH=6.0。

第一次進行增殖培養(yǎng)時將在無菌發(fā)芽培養(yǎng)基上獲得的無菌實生苗切除并棄去子葉、下胚軸及根系，將生長點轉接到該培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d 左右，后每隔30d 左右繼代增殖一次。每次繼代轉接時，將每株較大的無根苗切割成帶2～3 個節(jié)的莖段，較小的叢生芽則切割成單芽。每瓶接入五個莖段（或小芽）。

2.2.4.3 花芽誘導階段

該研究中利用ABA 誘導青葙無菌苗進行花芽分化。ABA 的濃度設5 個梯度，通過濃度梯度試驗篩選出最佳的ABA 濃度。各處理的編號及相應的ABA 濃度如表1 所示。

表1 青葙花芽誘導培養(yǎng)基中的ABA 濃度梯度設計Tab.1 ABA concentration gradients in the medium for flower buds induction in Celosia argentea L.

花芽誘導培養(yǎng)基的配方為：

MS+肌醇100mg/L+煙酸1.0mg/L+鹽酸硫胺素2.0mg/L+ 鹽酸吡哆素1.0mg/L+ 甘氨酸2.0mg/L+蔗糖3.0%+卡拉膠0.7%；pH=5.8。

青葙無菌苗在上述花芽誘導培養(yǎng)基上所培養(yǎng)的時間設以下兩個處理：

處理A：限定僅用該培養(yǎng)基預培養(yǎng)15d，然后將各個在ABA 濃度梯度處理上培養(yǎng)的材料分別轉接到后續(xù)的開花培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，令其在開花培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內開花。

處理B：用花芽誘導培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)（中途不轉接），至轉接后120d 時，才統(tǒng)計開花植株所占百分率。

2.2.4.4 成花培養(yǎng)階段

成花培養(yǎng)基所用的無機鹽系改良MS 培養(yǎng)基無機鹽，即在MS 培養(yǎng)基的基礎上將N 元素的用量減至MS 原始配方中用量的1/20，P 元素的用量提高到MS原始配方中用量的5 倍；與此同時，將蔗糖濃度由MS 原始配方中的2.0%提高到3.5%。即用低N，高P和高滲條件抑制營養(yǎng)生長，促進生殖生長。

成花培養(yǎng)基的配方為：

改良MS（×1/20 N；×5 P)+ 肌醇100mg/L+ 煙酸1.0mg/L+ 鹽酸硫胺素2.0mg/L+ 鹽酸吡哆素1.0mg/L+甘氨酸2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+蔗糖3.5%+卡拉膠粉0.7%；pH=5.8。

將在追加了不同濃度ABA 的花芽誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)了15d 的青葙無菌苗，分別轉接到該培養(yǎng)基上，培養(yǎng)45d 后統(tǒng)計開花植株所占百分率。

2.2.4.5 開花后保鮮培養(yǎng)階段

由于成花培養(yǎng)基中的N 元素調減至MS 原始配方中N 用量的1/20，故在成花培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個月后，大部分青葙無菌苗雖已開花，或已現(xiàn)蕾，但由于N 素嚴重虧缺，植株基部的葉片嚴重發(fā)黃或壞死脫落。為了提高觀賞價值和延長試管花的貨架期與觀賞期，應該及時將已現(xiàn)蕾的植株（包括已開花的植株）及時轉接到保鮮培養(yǎng)基上。轉接時在無菌條件下剪去基部的所有黃葉，修除植株的全部根系，然后轉接到無機鹽為常量MS 的保鮮培養(yǎng)基上令其葉片轉綠，花朵正常開放和發(fā)育，并延長花期和可用于賞花的時間。

保鮮培養(yǎng)基的基本成分如下：

MS+肌醇100mg/L+煙酸1.0mg/L+鹽酸硫胺素2.0mg/L+ 鹽酸吡哆素1.0mg/L+ 甘氨酸2.0mg/L+蔗糖3.5%+卡拉膠0.8%；pH=5.8。

3 結果與分析

3.1 種子無菌萌發(fā)情況

青葙種子接種到無菌發(fā)芽培養(yǎng)基上后，約經7d培養(yǎng)，即可觀察到逐漸有種子開始萌動，首先是胚根開始突破種皮延伸到培養(yǎng)基表面；之后，大多數(shù)種根插入培養(yǎng)基內部成為基內根，并長出有須根，也有少數(shù)實生苗的根不往下扎，而是緊貼著培養(yǎng)基的表面生長，或形成氣生根。隨著下胚軸的不斷延長，這種在培養(yǎng)基表面長根的實生苗往往會倒伏，或其頂端彎曲后再往上直立生長。青葙萌發(fā)出苗后，其下胚軸伸長較快，至接種后14d 左右時，植株株高可達1.0～1.5cm（圖1）。此時子葉平展，并開始長出真葉。至接種后28d 左右時，植株的株高達3.5～4.0cm 時如果實生種苗用于快繁增殖，即可將無菌實生苗在超凈工作臺上的無菌條件下取出，置于無菌不銹鋼盤上，切割成具2 葉2 節(jié)的莖段，并轉接到增殖培養(yǎng)基上。如擬將初代培養(yǎng)獲得的無菌實生苗在下一階段直接用于花芽誘導，則可令其在無菌發(fā)芽培養(yǎng)基上再培養(yǎng)28d，即在接種后第56d 時才轉接到花芽誘導培養(yǎng)基上（見2.2.4.3 節(jié)）。

圖1 無菌萌發(fā)的青葙實生苗(播種后10d)Fig.1 Aseptically germinated seedlings of Celosia argentea L. (10 d after sowing)

3.2 青葙無菌苗莖段離體快繁的效果

將株高6～8cm 的青葙無菌苗在超凈工作臺的無菌的條件下切割成3～4 個帶有2 葉2 節(jié)的莖段和頂芽，然后轉接到文中2.2.4.2 節(jié)所介紹的增殖培養(yǎng)基上，經8～10d 的培養(yǎng)，每個離體莖段一般均會發(fā)出一個腋芽，每個頂芽則直接生長形成無根苗，或偶有1～2 條短小的根。由于增殖培養(yǎng)基中添加有1.0mg/L 6-BA，故由莖段及頂芽再生出的植株一般不發(fā)根，或偶見少數(shù)植株長有1～2 條短根。經25～30d 培養(yǎng)，由莖段再生出的植株株高可達6～8cm（圖2）。此時又可再次切割成莖段進行離體快繁。每次繼代繁殖，增殖系數(shù)在3～4 左右?；蛘邔⑵浠康?/3 切除并棄去，將植株中上部轉移至花芽誘導培養(yǎng)基上。

圖2 青葙無菌增殖苗Fig.2 Sterile multiplication vaccine for Celosia argentea L.

3.3 不同濃度ABA 誘導花芽分化后轉接到成花培養(yǎng)基上的開花情況

將初代培養(yǎng)中獲得的青葙無菌實生苗，苗齡56d 左右時在超凈工作臺的無菌條件下從培養(yǎng)瓶中取出，置于無菌不銹鋼盤中，切除并棄去植株基部的1/3，將中上部轉接到追加有不同濃度ABA 的花芽誘導培養(yǎng)基的各種濃度梯度處理上（表1）培養(yǎng)15d，然后再轉接到修改的MS 培養(yǎng)基上（×1/20 N；×5 P）進行成花培養(yǎng)。至轉接后30d 時統(tǒng)計開花情況。實驗結果如表2 所示。

從表2 可以看出：在0.00mg/L～0.50mg/L 濃度范圍內，隨著預處理培養(yǎng)基中ABA 濃度的遞增，青葙無菌苗轉接到修改的MS 培養(yǎng)基上（×1/20 N；×5 P）培養(yǎng)30d 后，其開花植株所占的百分率會相應提高；再進一步提高ABA 濃度，其開花植株所占百分率又會明顯下降。

在無激素處理中（CK，ABA 濃度為0），雖有52%的植株能夠完成花芽分化，但在后續(xù)的成化培養(yǎng)基上[修改的MS 培養(yǎng)基（×1/20N；×5P）]，其花器官發(fā)育不良，花序短小。當ABA 濃度≥1.00mg/L 時，不僅開花植株百分率會急劇下降，而且即使有個別植株開花，其花器官也嚴重發(fā)育不良。表2 青葙無菌苗經用不同濃度ABA 預處理15d 后對試管內開花百分率的影響

Tab.2 Effects of pretreatment for 15 days with different ABA concentrations，on the percentages of flowering in-vitro plantlets ofCelosia argenteaL.

處理編號有效接種株數(shù)CK預處理條件開花植株株數(shù)（株）備注1 2 3 4(無激素)預處理15d ABA0.25mg/L預處理15d ABA 0.50mg/L；預處理15d ABA 1.00mg/L；預處理15ds ABA 2.00g/L；預處理15d 25 20 25 20 15 10 11 24 6 2開花植株百分率（%）52 55 96 30 13植株葉片發(fā)黃，部分基位葉脫落；有根發(fā)生，個別植株根系較發(fā)達，花序短小。植株基部葉片發(fā)黃，部分基位葉脫落；有根發(fā)生，不甚發(fā)達；花序大小較不均勻?；ㄐ蜉^大，且較均勻，花序長1.5cm 左右。有根發(fā)生。基部葉片發(fā)黃，部分葉脫落。植株個體大小不均勻，苗較細長；僅有少量根發(fā)生。開花株數(shù)量少；花序較短??；基部葉片發(fā)黃或脫落。僅在個別植株中出現(xiàn)花序，根量較少；基部葉片嚴重發(fā)黃或枯落。

3.4 在花芽誘導培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)120d 對青葙無菌苗植株試管內開花的影響

該研究中在探索用不同濃度的ABA 預處理青葙無菌苗15d，然后再將這些無菌苗轉接到修改的MS培養(yǎng)基上（×1/20 N；×5 P）以篩選出ABA 誘導青葙花芽分化的最適濃度的同時，還考慮到如果不將這些用ABA 處理過的青葙無菌苗轉接到成花培養(yǎng)基上再培養(yǎng)一段時間，這些無菌苗是否會開花？如果開花，開花植株百分率最高的又是哪一個處理？與轉接到成花培養(yǎng)基上的相應濃度梯度處理相比較，開花植株百分率是提高還是降低？在第二批試驗材料中，用同樣濃度梯度的ABA 處理120d（即中途不轉接到成花培養(yǎng)基上）。經觀察和統(tǒng)計，試驗結果如表3 所示。

從表3 可以看出：青葙無菌苗能夠在試管內開花，外源ABA 不是必須的；因為在無激素處理中（CK），仍有30.91%的植株開花。無激素處理的青葙無菌苗在培養(yǎng)90d 之后就陸續(xù)可以觀察到有植株開花。這表明，青葙無菌苗試管內開花與其內源ABA 激素和植株的苗齡有密切關系。

外源ABA 可以明顯地提高青葙無菌苗試管內開花的百分率，而且呈明顯的劑量關系：在0.00mg/L～0.50mg/L 范圍內，開花植株百分率隨著ABA 濃度的而提高；高峰范圍（平臺期）在0.50 mg/L～1.00mg/l，開花植株百分率維持在65.72%～67.28%之間；再增加ABA 濃度，開花植株百分率又明顯下降。

無論是預處理15d 馬上就轉接到成花培養(yǎng)基上（修改的MS：×1/20；×5P），還是一直留在花芽誘導培養(yǎng)基上至接種后120d，ABA 的最佳濃度梯度均為0.5mg/L，但轉接到修改的MS 培養(yǎng)基（成花培養(yǎng)基）上，其促進開花的效果更好，植株開花百分率由不轉接的處理之67.28%提升到96.0%。而且轉接到成花培養(yǎng)基上之后，花序較長而大，個體之間也比較均勻。

由于各個濃度梯度處理中的青葙無菌苗材料均是長期保持在同一種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而且中途沒有經過轉接，故各處理中的材料由于培養(yǎng)基中各種養(yǎng)分的不斷消耗，再加上植株所產生的有害代謝產物的長期積累，導致各葉片逐漸變黃。特別是在后期，基部葉片逐漸枯落。而且，不轉到成花培養(yǎng)基上的各個處理，其開花株的花序較短小，觀賞不如轉接到成花培養(yǎng)基上相應處理的那么高。因此，可認為：在青葙試管花培育過程中，在用0.5mg/L ABA 處理植株15d 之后，有必要及時轉接到成花培養(yǎng)基上。這不僅有利于提高開花植株百分率，而且可以提高青葙試管花的質量。

3.5 保鮮培養(yǎng)的效果

將已開花的植株，或者已現(xiàn)花蕾的植株，轉接到保鮮培養(yǎng)基上，約經10d 左右的培養(yǎng)，植株的葉片明顯轉綠，尚未開放的花蕾陸續(xù)開放。至培養(yǎng)12d～15d 時，每個植株基部會長出1～2 條根，根系不甚發(fā)達，但足以證明該試管花是一個完整植株（圖3）。試管花的主體是“花”，而不是“根”。如果根系太發(fā)達，不利于突出“花”這個主體。能保證青葙試管花“花紅葉綠”，而且有30d 以上的可觀賞期，是旅游產品“拇指花”或“試管花”的基本要求。該研究中開發(fā)出的青葙試管花產品，其觀賞期可達45d 左右，故可批量生產推向市場。

圖3 在保鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)的青葙開花植株Fig.3 Celosia argentea L. plants (flowering) grown on fresh-keeping medium

4 討論

4.1 關于ABA 處理時間對花芽的形成的影響問題

王志遠等人研究石斛（Dendrobium spp）離體培養(yǎng)中ABA 對誘導花芽形成的影響時，曾報道ABA預處理的時間長短，對于花芽誘導有明顯影響[12]。用0.5mg/L 預處理5d，再轉到含有6-BA 的MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)150d，花芽形成頻率為29.3%；預處理15d 培養(yǎng)150d 時花芽形成頻率為84.4%；預處理30d 培養(yǎng)150d 時則未見有花芽形成。該研究中用青葙做實驗材料發(fā)現(xiàn)：ABA 的濃度對花芽的影響更大，有明顯的劑量關系，即ABA 濃度與成花頻率之間呈拋物線關系。用ABA0.50 mg/L 長時間處理青葙120d 并不妨礙青葙花芽的形成，仍然呈明顯的劑量關系。但如果用0.50mg/L 處理15d 之后，馬上轉接到修改的MS成花培養(yǎng)基上（×1/20 N；×5 P）則會明顯提高ABA濃度梯度處理的花芽形成頻率。后續(xù)的成花培養(yǎng)基中降低N 素濃度和提高P 素濃度才是提高花芽形成的關鍵因素。因為，即使一直培養(yǎng)在附加0.50mg/L的培養(yǎng)基上，0.50mg/L ABA 處理中仍有60%以上的植株開花。因此，可認為這可能與物種的種性有關。對于青葙來說，苗齡、外源激素的濃度與處理時間，以及N 素和P 素的無機營養(yǎng)條件，均對花芽形成有影響。但以適宜的外源ABA 濃度（0.50mg/L）對青葙無菌苗的花芽形成頻率之影響最明顯。即使不追加外源ABA（CK），當培養(yǎng)至一定時間時亦有30%以上的植株形成花芽。這表明內源ABA 水平以及苗齡亦是影響青葙植株花芽形成的重要因素。

4.2 關于試管花相關應用技術的研發(fā)意義

自從中國學者羅士韋首次報道田野菟絲子（Cusouta compestris）在試管中開花以來，迄今為止，已有35 個科，共計100 余種植物實現(xiàn)了試管內開花，包括園藝作物、藥用植物和田間雜草，但其中以花卉的研究最多[13]。從實生苗、器官、組織，到原生質體，均可以作為外植體，在人工控制的試管條件下獲得花芽分化。但從已發(fā)表的有關試管開花植物的報道來看，絕大部分研究者是從基礎理論的研究角度來進行研究[14～15]。目前，關于試管花卉的觀賞性、貨架期、保鮮期，以及配套的培養(yǎng)瓶與包裝材料方面，很少有學者涉及。市面上試管花的商品形式主要靠各個商家自行研發(fā)，尚缺少科研單位的系統(tǒng)研發(fā)報道。實際上，試管花卉在國外已形成一個較大的產業(yè)，尤其是在歐美國家，情人節(jié)來臨時試管玫瑰花的銷量尤為火爆。因此，研究試管花的保鮮期，貨架期，外觀包裝以及包裝材料等等，具有重要意義，這有助于將試管花產品推向更廣闊的市場。