李浙峰 周光偉 王 峰 李 悅 徐 東 戴箴言

臨床上組織瓣移植手術(shù)是解決組織缺損和創(chuàng)面長(zhǎng)期不愈的有效方法。穿支皮瓣以符合“受區(qū)修復(fù)重建好，供區(qū)破壞損失小”的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床，成為組織缺損修復(fù)技術(shù)的研究熱點(diǎn)[1, 2]。穿支皮瓣僅以管徑細(xì)小的皮膚穿動(dòng)脈為蒂取瓣，故其供皮面積往往偏少，以三血管體為例，壞死常發(fā)生在潛在區(qū)，極大限制了穿支皮瓣的跨區(qū)切取。肉毒毒素(BTX)的應(yīng)用在近十年發(fā)展迅速，以往研究發(fā)現(xiàn)BTX可以通過(guò)擴(kuò)張血管改善皮瓣組織灌注，同時(shí)對(duì)皮瓣血管新生也起著重要的作用。而目前皮瓣領(lǐng)域研究較多的集中在A型肉毒毒素(BTX A)，對(duì)B型肉毒毒素(BTX B)近來(lái)也開始有所研究，BTX B與BTX A結(jié)構(gòu)和功能相似，目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道將BTX B局部應(yīng)用于choke Ⅱ區(qū)域以逆轉(zhuǎn)跨區(qū)穿支皮瓣潛在區(qū)壞死的研究。本研究擬觀察BTX B術(shù)中干預(yù)choke Ⅱ區(qū)對(duì)大鼠背部跨區(qū)穿支皮瓣成活的影響，并討論其作用機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)試劑及動(dòng)物:B型肉毒毒素：(愛(ài)爾蘭Elan制藥公司)，紅色氧化鉛Pb3O4(中國(guó)上海試劑總廠)，RT-PCR試劑盒(美國(guó)Thermo公司)，SYBR Green I Master(美國(guó)Roche公司)，TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)。雄性健康SD大鼠50只，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(浙)2005-0019，體重200～300g。

2.實(shí)驗(yàn)分組及模型制備：大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(B型肉毒毒素組)和對(duì)照組(生理鹽水組)，各25只。皮瓣掀起術(shù)后即刻，實(shí)驗(yàn)組在皮瓣choke Ⅱ區(qū)均勻皮下間隔0.2mm注射100U，總計(jì)1500U(約0.3ml)BTX B，對(duì)照組采用相同劑量生理鹽水均勻注射choke Ⅱ區(qū)[3]。所有動(dòng)物用戊巴比妥鈉麻醉(30mg/kg，腹腔注射)，采用Yang等[4]大鼠皮瓣制作方法，在背部以后正中線為內(nèi)側(cè)緣，髂后上棘連線為下界，肩胛下角為上界，設(shè)計(jì)保留一側(cè)髂腰深動(dòng)脈穿支為蒂的背部三血管體穿支皮瓣，面積約為9cm×3cm皮瓣。切開皮瓣四周皮膚后，在深筋膜層面完全游離皮瓣，在皮瓣掀起后即刻，按上述方法注射BTX B或生理鹽水，然后用4-0慕斯線，原位縫合(圖1)。手術(shù)后1～3天，8萬(wàn)單位青霉素G腹腔注射，1次/天。

圖1 切取以髂腰動(dòng)脈穿支為蒂的跨區(qū)三血管體穿支皮瓣，將皮瓣原位縫合，choke Ⅰ及choke Ⅱ區(qū)中央?yún)^(qū)用苦味酸標(biāo)記A.切取皮瓣;DCI.髂腰動(dòng)脈穿支;IC.肋間后動(dòng)脈穿支;TD.胸背動(dòng)脈穿支;B.將皮瓣原位縫合

3.觀察指標(biāo):(1)皮瓣觀察及記錄皮瓣成活:術(shù)后第7天麻醉下數(shù)碼相機(jī)拍攝高質(zhì)量圖片，導(dǎo)入計(jì)算機(jī)圖像軟件(M2 Image Analysis System)計(jì)算皮瓣成活面積百分比，即皮瓣成活率。皮瓣壞死標(biāo)準(zhǔn)包括組織回縮、彈性差，質(zhì)地堅(jiān)硬，切割組織不出血。(2)明膠-氧化鉛血管造影:分別于術(shù)后第7天取對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組各5只大鼠，采用明膠-氧化鉛灌注法對(duì)大鼠行全身灌注血管造影。麻醉下將22-規(guī)格容量留置針置入大鼠頸總動(dòng)脈，放血排盡大鼠體內(nèi)血液，注入1%肝素1.5ml，用20ml注射器將配置好的20ml明膠-氧化鉛混合物(含明膠1g、四氧化三鉛20g、蒸餾水20ml)注入頸總動(dòng)脈，直至大鼠鞏膜及四肢末端顯現(xiàn)出點(diǎn)狀、斑片狀紅色。然后將灌注后標(biāo)本置于4℃冰箱冷藏24h后，切取大鼠背部皮瓣，平鋪行X線攝影。(3)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測(cè)VEGF、HIF-1α表達(dá)：術(shù)后第7天將大鼠處死，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各10只，取跨區(qū)穿支皮瓣choke Ⅱ區(qū)中央?yún)^(qū)域皮瓣組織。將切取的組織塊(約100mg)置于1ml Trizol液中，采用生物勻漿機(jī)(Master Prep，MAK 6075-047 Hichuang bioer，中國(guó))勻漿，按照Trizol法提取組織中總RNA，采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度及濃度(A260/A280>1.8)。根據(jù)濃度取1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。VEGF上游引物5′- CTGCTGTACCTCCACCATGC -3′，下游引物5′- CTGGCTTTGGTGAGGTTTGA -3′；HIF-1α上游引物5′- GATGGCTCCCTTTTTCAAGC- 3′，下游引物5′-TTTCTGCTGCCTTGTATGGG- 3′；β-actin上游引物5′- AGTTGAGGGGGACTTTCCCAGG -3′，下游引物5′- CCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT -3′(由美國(guó)Invitrogen公司合成)。在無(wú)菌去酶的 Eppendorf 管中將配置好的 Real-time PCR反應(yīng)液(反應(yīng)總體積為 20μl)離心數(shù)秒，混勻后迅速置入Roche LightCycier?480 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀中，采用兩步法qRT-PCR擴(kuò)增程序：Stage One預(yù)變性 95℃ 5min，Stage two95 ℃，10s，60℃ 10s，72℃ 10s，共45個(gè)循環(huán)，獲得各樣本待測(cè)基因的Ct值，采用ΔΔCt法進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,其結(jié)果代表目的基因表達(dá)的相對(duì)定量，以對(duì)照組作為矯正樣本。(4)組織學(xué)檢測(cè):術(shù)后第7天取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各10只，切取跨區(qū)穿支皮瓣蒂部及choke Ⅱ區(qū)中央?yún)^(qū)域組織，面積約3cm×0.5cm，以10%甲醛溶液固定組織塊，常規(guī)脫水包埋，制成3～4μm厚的切片并行HE染色。術(shù)后7天在10×10倍鏡下在蒂部區(qū)域測(cè)量穿支動(dòng)脈管徑，管徑=(最大橫徑+最大縱徑)/2。于10×10倍視野下，在choke Ⅱ區(qū)中央?yún)^(qū)域找到微血管密集區(qū)，然后于20×10倍光鏡下隨意選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)血管數(shù)并取平均值，計(jì)算出單位面積微血管數(shù)(個(gè)/平方毫米)作為評(píng)價(jià)微血管密度(MVD)的指標(biāo)。

結(jié) 果

1.皮瓣大體觀察及成活率:術(shù)后第7天，兩組皮瓣遠(yuǎn)端壞死部分均趨于融合，手感變硬，呈干性壞死，界線清晰(圖2)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組背部皮瓣壞死率分別為90.0%±2.9%和75.0%±3.2%，實(shí)驗(yàn)組皮瓣的成活面積顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 術(shù)后7天大鼠背部三血管體穿支皮瓣的成活情況A.對(duì)照組;B.實(shí)驗(yàn)組

2.明膠-氧化鉛照影:實(shí)驗(yàn)組各血管體區(qū)血管結(jié)構(gòu)較為完整，choke Ⅰ及Ⅱ區(qū)血管結(jié)構(gòu)清晰。在choke Ⅰ及Ⅱ區(qū)出現(xiàn)了大量的真性吻合(choke血管擴(kuò)張)。遠(yuǎn)端壞死區(qū)域顯示胸背動(dòng)脈穿支入皮點(diǎn)以遠(yuǎn)僅部分紊亂或消失。對(duì)照組明膠-氧化鉛造影示choke Ⅰ區(qū)、choke Ⅱ區(qū)的choke血管擴(kuò)張不顯著，第三血管體區(qū)血管結(jié)構(gòu)較為紊亂，遠(yuǎn)端壞死區(qū)域顯示胸背動(dòng)脈穿支入皮點(diǎn)附近及遠(yuǎn)端血管結(jié)構(gòu)紊亂或消失(圖3)。

圖3 大鼠背部三血管體皮瓣模型動(dòng)脈造影A和B分別為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組術(shù)后7天明膠-氧化鉛動(dòng)脈造影圖。在choke區(qū)，實(shí)驗(yàn)組A較對(duì)照組B出現(xiàn)了大量的真性吻合(真性吻合為管徑變粗的choke血管)

3.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測(cè)VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)：術(shù)后第7天，實(shí)驗(yàn)組VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)均較對(duì)照組有所提高。實(shí)驗(yàn)組choke Ⅱ區(qū)VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)量分別為2.10±0.56、1.98±0.33，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測(cè)choke Ⅱ區(qū)的VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組比較，*P<0.01

4.組織學(xué)檢測(cè):兩組皮瓣蒂部區(qū)的組織形態(tài)無(wú)明顯差異，實(shí)驗(yàn)組穿支動(dòng)脈的管徑較對(duì)照組明顯增大(圖5)。實(shí)驗(yàn)組穿支動(dòng)脈管徑及對(duì)照組穿支動(dòng)脈管徑分別為158.00±20.12μm、83.33±12.79μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在choke Ⅱ區(qū)組織中，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組微血管計(jì)數(shù)增多，分別為(43.36±9.11)個(gè)/平方毫米和(34.16±7.12)個(gè)/平方毫米，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組皮瓣蒂部穿支動(dòng)脈區(qū)組織HE染色(×100)A.對(duì)照組穿支動(dòng)脈(a)及靜脈(V)； B.實(shí)驗(yàn)組穿支動(dòng)脈(a)及靜脈(V)

討 論

以往研究發(fā)現(xiàn)跨區(qū)穿支皮瓣壞死常常發(fā)生在潛在區(qū)，從而在根本上大大限制了跨區(qū)穿支皮瓣的擴(kuò)大切取[5～8]。與此相反，動(dòng)力學(xué)區(qū)往往都能成活，可能與 choke 區(qū)管徑小、血流阻力大有關(guān)，當(dāng)源動(dòng)脈供應(yīng)血流跨越動(dòng)力學(xué)區(qū)至choke Ⅱ區(qū)時(shí)，減少的血流量已無(wú)法滿足潛在區(qū)組織代謝及成活[9]。另一方面，血管新生歷來(lái)被認(rèn)為與皮瓣成活密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)外大量的研究顯示血管新生參與了皮瓣的成活[10]。因此采取某種行之有效的方法使這3個(gè)不同供區(qū)之間的吻合血管開放、擴(kuò)張乃至血管新生，進(jìn)而通過(guò)新建的血液循環(huán)體系將3個(gè)不同的小供區(qū)變成一個(gè)大供區(qū)，可以提高跨區(qū)穿支皮瓣的成活率。

BTX由肉毒桿菌產(chǎn)生，屬于多肽，從A至G，有7種血清型。BTX雖然有7種不同類型，但結(jié)構(gòu)和功能相似。近來(lái)，越來(lái)越多的研究證明，BTX對(duì)血管有著不同程度的影響。首先BTX可以在神經(jīng)肌肉連接處抑制乙酰膽堿的釋放，通過(guò)化學(xué)去神經(jīng)化作用于受交感神經(jīng)系統(tǒng)支配的血管平滑肌細(xì)胞[11]。其次，BTX作用于Rho激酶，通過(guò)影響血管平滑肌細(xì)胞對(duì)鈣離子的敏感度及NO系統(tǒng)直接抑制平滑肌細(xì)胞的收縮，從而使得血管擴(kuò)張[12, 13]。另外，研究發(fā)現(xiàn)BTX A可以通過(guò)減弱自主神經(jīng)釋放去甲腎上腺素來(lái)抑制交感神經(jīng)收縮血管[14]。因此，BTX可以通過(guò)擴(kuò)張血管改善皮瓣組織灌注、氧攜帶量、代謝，最終提高皮瓣的成活率。Park等[3]報(bào)道吻合大鼠股動(dòng)靜脈術(shù)前3天將BTX B局部注射于股動(dòng)脈周圍，隨后分別測(cè)量吻合前后股動(dòng)靜脈管徑以及血流速度，發(fā)現(xiàn)經(jīng)BTX B預(yù)處理后誘導(dǎo)了血管擴(kuò)張，減少了血管阻力，因此血流速度得到明顯增加，從而也有效地預(yù)防了血栓的形成。筆者的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組中皮瓣choke Ⅰ及choke Ⅱ區(qū)choke血管真性吻合較明顯多于對(duì)照組，從而改善了皮瓣遠(yuǎn)端的灌注。Arnold等[15]報(bào)道，將BTX A局部浸潤(rùn)1支三血管體皮瓣蒂部血管，結(jié)果并未明顯提高皮瓣成活率及改善缺血區(qū)域，其分析原因可能是BTX A保護(hù)作用可能在遠(yuǎn)期，而本實(shí)驗(yàn)提示BTX B干預(yù)后皮瓣成活率明顯增加，可能與BTX B在早期起效后通過(guò)擴(kuò)張choke 血管改善了皮瓣血循環(huán)。

BTX對(duì)皮瓣血管新生也起著重要的作用。VEGF在改善皮瓣成活方面，是目前研究最為廣泛且最為成功的生物因子[16]。它是缺氧組織在病理或者生理?xiàng)l件下釋放的，是調(diào)節(jié)血管新生的關(guān)鍵因子[17]。Patel等[18]證實(shí)經(jīng)BTX A局部注射預(yù)處理后的大鼠腹直肌(TRAM)皮瓣中，蒂部血管管徑、VEGF、CD31均有明顯提高。Kim等[19]同樣也報(bào)道，經(jīng)BTX A干預(yù)后的大鼠背部隨意皮瓣組織中，血管管徑增加,微血管數(shù)量明顯增多，一些被認(rèn)為與血管擴(kuò)張及血管內(nèi)皮細(xì)胞增生有關(guān)的生物分子，如VEGF、CD31及iNOS，含量也明顯提高。隨后，Park等[20]又報(bào)道了經(jīng)BTX A術(shù)前預(yù)處理后的大鼠TRAM皮瓣組織中，CD34、VEGF、HIF-1α的含量均有明顯提高，認(rèn)為BTX A可能通過(guò)HIF-1α/VEGF通路改善了皮瓣血管新生，從而促進(jìn)了TRAM皮瓣的成活率。VEGF是處于HIF-1α下游序列的靶基因，而HIF-1α是一種可以調(diào)節(jié)體內(nèi)氧平衡和血管新生的轉(zhuǎn)錄因子，VEGF的上調(diào)作用可能來(lái)自HIF-1α[21]。筆者發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組choke Ⅱ區(qū)，HIF-1α、VEGF的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，其可能原因是通過(guò)對(duì)HIF-1α的積累增加了 VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)了choke Ⅱ區(qū)血管新生，進(jìn)而促進(jìn)了跨區(qū)穿支皮瓣的成活率，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組蒂部穿支血管第管徑較對(duì)照組明顯擴(kuò)張，其原因可能正是由于通過(guò)choke 血管的擴(kuò)張及choke Ⅱ的血管新生帶動(dòng)了整個(gè)皮瓣的血流量的增加，從而反饋性的擴(kuò)張了蒂部穿支動(dòng)脈的管徑，但需進(jìn)一步對(duì)血流量的改變進(jìn)行研究。

綜上所述，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果及皮瓣成活情況，應(yīng)用B型肉毒毒素術(shù)中干預(yù)choke Ⅱ區(qū)能有效地刺激大鼠背部跨區(qū)穿支皮瓣血管新生，擴(kuò)張choke血管增加皮瓣遠(yuǎn)端的血流供應(yīng)量，同時(shí)擴(kuò)張了蒂部穿支動(dòng)脈，從而降低了跨區(qū)穿支皮瓣潛在區(qū)的壞死率。