陳方慧 王 弋 方金燕 吳澤生 陳子晞 謝 贇 肖 晨 趙 雪

銀杏內(nèi)酯B (ginkgolide B,GB) 是銀杏葉的主要提取物，對血小板活化因子具有明顯的拮抗作用，已用于治療血栓形成、急性胰腺炎和心血管疾病等疾患[1]。GB可顯著抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但具體機(jī)制尚不明確[2]。Omi/HtrA2是一種由線粒體產(chǎn)生并可進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的絲氨酸蛋白酶。X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)是內(nèi)源性的caspases抑制物；而Omi/HtrA2通過降解XIAP來增強(qiáng)caspase活性從而參與線粒體凋亡途徑發(fā)揮致凋亡作用[3～6]。線粒體Omi/HtrA2信號通路參與大鼠膿毒癥性腦病、幼鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)和大鼠腦缺血/灌注損傷中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程[7～9]。但目前少有研究揭示該信號途徑在顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用。本研究檢測顱腦損傷大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡，觀察Omi/HtrA2通路上XIAP、pro-caspase 3和pro-caspase 9等蛋白的表達(dá)及GB的干預(yù)作用，從而揭示大鼠顱腦損傷后Omi/HtrA2介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡線粒體途徑的激活及GB抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的信號通路。

材料與方法

1.材料：健康Wistar大鼠(南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，雄性，清潔級)；GB(規(guī)格：10mg，批號：15291-77-7，上海諾辰生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(批號：23256，美國Thermo Scientific公司)；TUNEL試劑盒(批號：TUN11684817，北京嘉美紐諾生物科技有限公司)；caspase-3和caspase-9底物(批號：T9281、T9275，美國Livemore公司)；轉(zhuǎn)印槽(型號：Trans-Blot，美國Biorad公司)；電泳儀(型號：BG-caTANK，北京百晶生物技術(shù)有限公司)；小型垂直電泳槽(型號：164-8001，美國Biorad公司)；脫色搖床(型號：RCK 2D 200，上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司)；生物倒置顯微鏡(型號：IX-71，中國奧林巴斯有限公司)；低溫高速離心機(jī)(型號：TD4，鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司)；熒光分光光度儀(型號：B-500，上海元析儀器有限公司)。

2.方法：本實(shí)驗(yàn)設(shè)立假手術(shù)組、腦外傷組和治療組，隨機(jī)分配30只大鼠，每組10只。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉后，取右側(cè)冠狀縫后1mm和中線旁開2mm為撞擊位點(diǎn)，切開頭皮后，鉆直徑5mm骨孔一枚，采用Feeney自由落體損傷裝置，選擇40g重?fù)翦N從25cm處自由墜落沖擊撞桿，打擊深度5mm，縫合頭皮。腦外傷組和治療組大鼠按上述標(biāo)準(zhǔn)制作大鼠顱腦損傷模型，假手術(shù)組大鼠切開頭皮但未作自由落體打擊。模型形成前0.5h，治療組大鼠予以20mg/(kg·d) GB腹腔注射，其余兩組大鼠腹腔注射1ml 0.9%氯化鈉溶液，均連續(xù)用藥3天。在第3天，取大鼠以80mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉后斷頭處死，分離海馬組織。假手術(shù)組、腦外傷組和治療組3天內(nèi)死亡大鼠依次是1、2和2只。大鼠死亡后補(bǔ)充成活大鼠，保證每組10只大鼠。3組大鼠病死率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.516,P=0.773)。

3.細(xì)胞凋亡檢測： 采用石蠟包埋大鼠海馬組織，切取厚約4μm切片，按照說明書采用TUNEL法檢測海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡。凋亡神經(jīng)細(xì)胞為細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色或棕紅色。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算10個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，總計(jì)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算平均陽性率(%)。

4.蛋白表達(dá)的檢測:采用BCA法測定大鼠海馬組織蛋白濃度，采用Western blot法檢測大鼠海馬組織Omi/HtrA2、XIAP、pro-caspase-3、pro-caspase-9和剪切PARP蛋白表達(dá)，結(jié)果用quality one軟件分析雜交條帶灰度值，以β-actin水平為內(nèi)對照，比較相對灰度值。

5.蛋白活性的檢測:采用四肽熒光底物法檢測海馬組織caspase-3和caspase-9蛋白活性。采用熒光分光光度計(jì)，取激發(fā)波長400nm和釋放波長505nm處測定熒光強(qiáng)度。以未加腦組織時(shí)的熒光強(qiáng)度為參照值，計(jì)算熒光強(qiáng)度，最終比較相對熒光強(qiáng)度。

結(jié) 果

1.GB對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響:由圖1和圖2可見，3組大鼠凋亡的海馬神經(jīng)元比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=157.806，P<0.01)。腦外傷組大鼠凋亡的海馬神經(jīng)元比例較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)，而治療組大鼠凋亡的海馬神經(jīng)元比例較腦外傷組顯著下降(P<0.01)。

圖1 GB對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響 (TUNEL，×100)A.假手術(shù)組；B.腦外傷組；C.治療組

圖2 GB對大鼠海馬凋亡神經(jīng)元比例的影響與腦外傷組比較，*P<0.01

2.GB對大鼠海馬組織Omi/HtrA2、pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP 和XIAP蛋白表達(dá)的影響：由圖3～圖8可見，3組大鼠海馬組織Omi/HtrA2、pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP 和XIAP蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=85.538、104.546、89.650、63.168和53.096，P均<0.01)。腦外傷組大鼠海馬組織Omi/HtrA2、pro-caspase-3、pro-caspase-9和剪切PARP蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)，腦外傷組大鼠海馬組織XIAP蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著下降(P<0.01)；治療組大鼠海馬組織Omi/HtrA2、pro-caspase-3、pro-caspase-9和剪切PARP蛋白表達(dá)均較腦外傷組顯著下降(P均<0.01)，治療組大鼠海馬組織XIAP蛋白表達(dá)較腦外傷組顯著升高(P<0.01)。

圖3 GB對大鼠海馬組織Omi/HtrA2、pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP 和XIAP蛋白表達(dá)的影響

圖4 GB對大鼠海馬組織Omi/HtrA2蛋白表達(dá)相對值的影響與腦外傷組比較，*P<0.01

圖5 GB對大鼠海馬組織pro-caspase-3蛋白表達(dá)相對值的影響與腦外傷組比較，*P<0.01

圖6 GB對大鼠海馬組織pro-caspase-9蛋白表達(dá)相對值的影響與腦外傷組比較，*P<0.01

圖7 GB對大鼠海馬組織剪切的PARP蛋白表達(dá)相對值的影響與腦外傷組比較，*P<0.01

圖8 GB對大鼠海馬組織剪切的XIAP蛋白表達(dá)相對值的影響與腦外傷組比較，*P<0.01

圖9 GB對大鼠海馬組織caspase-3蛋白活性相對值的影響與腦外傷組比較，*P<0.01

圖10 GB對大鼠海馬組織caspase-9蛋白活性相對值的影響與腦外傷組比較，*P<0.01

3.GB對大鼠海馬組織caspase-3和caspase-9蛋白活性的影響：由圖9和圖10可見，3組大鼠海馬組織caspase-3和caspase-9蛋白活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.716和53.067，P均<0.01)。腦外傷組大鼠海馬組織caspase-3和caspase-9蛋白活性均較假手術(shù)組顯著升高(P均<0.01)，治療組大鼠海馬組織caspase-3和caspase-9蛋白活性均較腦外傷組顯著下降(P均<0.01)。

討 論

顱腦損傷是一種嚴(yán)重的外傷形式，發(fā)生率居四肢創(chuàng)傷之后，但病死率和致殘率居所有外傷之首。顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷的病理生理機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，涉及炎性反應(yīng)、自由基反應(yīng)、氨基酸毒性作用和細(xì)胞凋亡等[10～13]。哺乳細(xì)胞涉及外在途徑、內(nèi)在途徑(即線粒體途徑)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑在內(nèi)的3種基本的細(xì)胞凋亡途徑。線粒體凋亡是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一，是一種由凋亡基因調(diào)控的高度保守的死亡過程。炎性介質(zhì)、缺血、缺氧及外傷等外在或內(nèi)在的凋亡信號作用于線粒體，通過改變線粒體膜的通透性，導(dǎo)致線粒體內(nèi)相關(guān)物質(zhì)釋放入胞質(zhì)，從而介導(dǎo)線粒體乃至細(xì)胞的凋亡，因此線粒體可能在細(xì)胞凋亡中起到主開關(guān)的作用[14～16]。研究證實(shí)，線粒體途徑參與顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過程[17～19]。然而，線粒體途徑也涉及復(fù)雜的信號傳遞通路，剖析這些信號通路對進(jìn)一步揭示外傷性腦損傷的病理生理機(jī)制具有重要意義，也為繼發(fā)性腦損傷的藥物治療提供新思路。

Omi/HtrA2是一種在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，由MTS/MLS引導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體的絲氨酸蛋白酶。Omi/HtrA2在線粒體內(nèi)可通過自身蛋白酶解或被加工肽酶降解形成成熟Omi分子，并儲存在線粒體膜間隙中。線粒體膜在細(xì)胞受到刺激發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)通透性增加，Omi/HtrA2分子則從線粒體釋放并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[3～6]。XIAP是內(nèi)源性caspases抑制物，可結(jié)合和抑制活化的caspase-9。Omi/HtrA2分子在細(xì)胞受到刺激后被釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而降解XIAP，解除XIAP對caspase-9的抑制，導(dǎo)致下游caspase-3活化，從而DNA斷裂發(fā)生凋亡，即Omi/HtrA2通過增強(qiáng)caspase活性參與線粒體凋亡途徑發(fā)揮致凋亡作用[3～6]。線粒體Omi/HtrA2信號通路參與了膿毒癥性腦病、癲癇持續(xù)狀態(tài)幼鼠和腦缺血/灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程[7～9]。本研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷大鼠海馬組織Omi/HtrA2、pro-caspase-3、pro-caspase-9和剪切PARP蛋白表達(dá)及caspase-3和caspase-9蛋白活性出現(xiàn)明顯的升高，而XIAP蛋白表達(dá)出現(xiàn)了下調(diào)。因此，線粒體Omi/HtrA2信號通路可能參與了顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

銀杏是地球上最古老的植物之一，具有獨(dú)特的藥理作用和治療價(jià)值。GB為銀杏葉提取物中主要的藥效成分之一，為二萜類酸化合物[1]。GB能通過降低Bax和caspase-3表達(dá)，增加Bcl-2表達(dá)，抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[20]。GB可通過抑制核因子-κB/Toll樣受體4途徑影響神經(jīng)炎性反應(yīng)，從而降低腦出血或腦外傷大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[21,22]。目前，GB是否通過抑制細(xì)胞凋亡線粒體途徑而降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡還不得而知。本研究發(fā)現(xiàn)，使用GB腹腔注射后，顱腦損傷大鼠海馬組織Omi/HtrA2、pro-caspase-3、pro-caspase-9和剪切PARP蛋白表達(dá)及caspase-3和caspase-9蛋白活性出現(xiàn)明顯的下降，而XIAP蛋白表達(dá)出現(xiàn)了上升。因此，可以推測，抑制線粒體Omi/HtrA2信號通路可能是GB抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。