劉文華 陶潞淵 徐恩國(guó)

心房顫動(dòng)(以下簡(jiǎn)稱房顫)是指心房以無規(guī)則、快序、紊亂的顫動(dòng)波取代了規(guī)則有序的電活動(dòng)，導(dǎo)致心房失去了有效的收縮功能，是臨床上最嚴(yán)重的心房電活動(dòng)紊亂[1，2]。非瓣膜性房顫是房顫的重點(diǎn)，其所占比例明顯高于瓣膜性房顫[3]。非瓣膜性房顫易導(dǎo)致心房血液淤滯，易形成血栓，血栓并發(fā)急性心肌梗死是非瓣膜性房顫最大的危害。我國(guó)每年約有 170 萬人因非瓣膜性房顫并發(fā)急性心肌梗死而入院，其30 天再發(fā)心肌梗死率為8%～10%，心力衰竭發(fā)生率為15%～30%，病死率為6%～8%[4,5]。微小RNA(microRNA，miRNA)能調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平后的基因翻譯，其機(jī)制為結(jié)合信使RNA的3′端非翻譯區(qū)進(jìn)行調(diào)控，此外胚胎的發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化均與miRNA關(guān)系密切[6，7]。miR-150低表達(dá)還可致使血管內(nèi)皮嚴(yán)重?fù)p傷，激活凝血反應(yīng)鏈，導(dǎo)致纖維蛋白及免疫球蛋白也應(yīng)激增高，形成高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)，終致血液黏滯性及凝固性增加而處于高凝狀態(tài)或血栓前狀態(tài)，進(jìn)一步誘發(fā)心房顫動(dòng)及心力衰竭的產(chǎn)生[8，9]。在急性心肌炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎中，miR-486表達(dá)降低，提示miR-486在此類疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用[10]。本研究擬探討非瓣膜病房顫患者患者血清miR-486和miR-150水平其臨床診斷價(jià)值，并與傳統(tǒng)的非瓣膜病房顫評(píng)價(jià)指標(biāo)左心房?jī)?nèi)徑(left atrial diameter，LAD)及左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction ，LVEF)為非瓣膜病房顫的早期診斷及治療提供理論及實(shí)踐基礎(chǔ)。

資料與方法

1.一般資料：選取2015年10月～2017年11月在筆者醫(yī)院心血管內(nèi)科確診的非瓣膜病房顫患者80例為病例組，經(jīng)臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查(血常規(guī)、血生化)及心電圖、冠脈造影診斷確診, 符合2013 年《美國(guó)心房顫動(dòng)管理治療指南》[11]診斷標(biāo)準(zhǔn)(心房顫動(dòng)是一種室上性快速心律失常，出現(xiàn)不協(xié)調(diào)的心房激動(dòng)并導(dǎo)致心房收縮無效), 且心電圖特診包括規(guī)則有序的 P 波消失R-R 間期不規(guī)則，代以不規(guī)則的心房顫動(dòng)波。選擇同時(shí)期于筆者醫(yī)院門診健康體檢者76例作為對(duì)照組，對(duì)照組均無既往肺栓塞病史、惡性腫瘤、6周內(nèi)手術(shù)史、下肢外傷史、心功能不全、腦血管意外、長(zhǎng)期臥床史。對(duì)照組76例，其中，男性36例，女性40例，患者年齡46～70歲，平均年齡58.7±12.7歲。均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者 LDL-C水平超過 100mg/dl；既往有短暫腦缺血發(fā)作或缺血性卒中或體循環(huán)動(dòng)脈栓塞史；初中以上文化水平；控制良好的輕、中度高血壓(血壓≤160/100mmHg)。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批；所有患者(或患者直系親屬)均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：可逆性因素所致非瓣膜病房；孕婦或近3個(gè)月有手術(shù)、創(chuàng)傷史；冠心病以外的其他心臟病、心功能不全，合并未控制的嚴(yán)重高血壓、瓣膜性心臟病以及急診冠狀動(dòng)脈介入治療者。終止、退出標(biāo)準(zhǔn)：患者依從性差；出現(xiàn)嚴(yán)重不良事件及其他原因致使繼續(xù)試驗(yàn)困難。

2.主要儀器及試劑：貝克曼AU-480全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)庫爾特公司)、S2000心臟彩色超聲多普勒分析儀(德國(guó)西門子公司)、Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品)、miR-486、miR-150基因的表達(dá)測(cè)定采用UltraSYBR One Step RNA PCR Kit(寶生物工程大連有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)、NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)、恒溫培養(yǎng)箱grp-9080(美國(guó)通用公司)、超凈工作臺(tái)(上海恒躍醫(yī)療器械有限公司)。 TG、HDL-C、LDL-C試劑盒為AU-480全自動(dòng)生化分析儀原廠自帶試劑。

3.方法：S2000心臟彩色超聲多普勒分析儀測(cè)定病例組及對(duì)照組患者LAD、LVEF(%)。同時(shí)病例組及對(duì)照組患者清晨空腹及肱靜脈抽血；取靜脈血10ml置于無菌管中，室溫靜置30min，3000r/min離心,10min，分離血清，貝克曼AU-480全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol ，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol ，LDL-C)，剩余血清用于測(cè)定miR-486、miR-150基因的表達(dá)，參照GenBank 數(shù)據(jù)獲取 2 個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)待測(cè)基因位點(diǎn)的PCR 擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，按20μl 模板和 50μl 反應(yīng)液構(gòu)成 PCR 反應(yīng)體系， 擴(kuò)增程序:95℃ 5min; 93℃10s，61℃ 30s，重復(fù) 40個(gè)循環(huán)，61℃ 時(shí)采集熒光(表1)，RT-PCR反應(yīng)體系為：2×超級(jí)賽博一步法 RT-qPCR 緩沖液5μl，正向引物(10μmol/L) 0.4μl，反向引物(10μmol/L)0.4μl，超級(jí)酶混合物0.2μl，RNA模板0.6μl，去核糖核酸酶水3.4μl。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀檢測(cè)其表達(dá)量。

表1 miR-486、miR-150引物序列

結(jié) 果

1.兩組一般情況比較：由表2可見，兩組在性別、年齡、BMI、吸煙、冠心病、糖尿病、飲酒、高血壓、高脂血癥等一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 兩組一般情況比較

2.兩組miR-486、miR-150指標(biāo)比較：由表3可見，病例組miR-486、miR-150表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.54、19.02，P<0.05)。

表3 兩組miR-486、miR-150指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，*P<0.05

3.兩組血脂指標(biāo)比較：由表4可見，病例組HDL-C水平低于對(duì)照組，TG、LDL-C水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.43、18.13、20.16，P<0.05)。

表4 兩組血脂指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，*P<0.05

4.兩組LAD、 LVEF常規(guī)評(píng)價(jià)指標(biāo)比較：由表5可見，病例組LAD水平高于對(duì)照組，LVEF水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.43、20.42，P<0.05)。

表5 兩組LAD、 LVEF常規(guī)評(píng)價(jià)指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，*P<0.05

5.miR-486、miR-150與各指標(biāo)相關(guān)性分析：由表6可見，miR-486、miR-150與TG、HDL-C、LDL-C、LAD呈負(fù)相關(guān)，與LVEF呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R=-0.541、-0.567、-0.569、-0.624、-0.498、-0.501、-0.566、-0.594，0.644、0.587，P<0.05)。

6.各指標(biāo)診斷非瓣膜病心房顫動(dòng)的價(jià)值分析：由表7可見，診斷非瓣膜病心房顫動(dòng)時(shí)，miR-486、miR-150的AUC與LVEF相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.65、1.52，P>0.05), miR-486、miR-150的AUC均高于LAD 、TG、HDL-C、LDL-C，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=14.67、13.57、15.32、11.78、13.41、15.78、12.14、13.98，P<0.05)。

表6 miR-486、miR-150與各指標(biāo)相關(guān)性分析

表7 各指標(biāo)診斷非瓣膜病心房顫動(dòng)的價(jià)值分析

討 論

miRNA是在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種具有高度進(jìn)化保守性的非編碼小 RNA。作為較早發(fā)現(xiàn)的一種 miRNA，其在調(diào)控細(xì)胞的基因表達(dá)方面有極其重要的作用，同時(shí)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也扮演者重要的角色[12]。經(jīng)典的miRNA作用途徑是通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)的3’端非編碼區(qū)特異性結(jié)合抑制miRNA的翻譯。

研究發(fā)現(xiàn)miR-486蛋白可介導(dǎo)細(xì)胞的定向轉(zhuǎn)移和趨化性，并激活淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞上相應(yīng)的趨化因子受體[13]。miR-486在調(diào)節(jié)人體細(xì)胞的復(fù)制、遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)損傷修復(fù)、以及炎性細(xì)胞的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移等方面有重要作用。遺傳基因?qū)W發(fā)現(xiàn)miR-486過表達(dá)是引發(fā)大部分自身性炎性反應(yīng)的主要原因，高度表達(dá)miR-150蛋白的淋巴細(xì)胞株增殖能力明顯高于野生株[14]。miR-486 mRNA除了具有經(jīng)典的miRNA作用方式，還存在非經(jīng)典的miRNA作用方式，即與靶mRNA的結(jié)合方式：miR-486 mRNA與靶mRNA的5′端結(jié)合可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后抑制的作用；一項(xiàng)研究表明，下調(diào)miR-486可能導(dǎo)致鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶對(duì)蘭尼堿受體2在 S2814 位點(diǎn)的過度磷酸化，其機(jī)制與miR-486抑制蛋白磷酸酶2(protein phosphatase 2,PP2A )調(diào)節(jié)亞單位 B56α有關(guān)，進(jìn)而促使肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子大量釋放，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣循環(huán)穩(wěn)態(tài)失衡，心肌興奮-收縮耦聯(lián)增強(qiáng)，蘭尼堿受體2鈣離子通道的活性加強(qiáng)，導(dǎo)致房顫發(fā)生[15]。Forman等發(fā)現(xiàn)let-7a可作用于Dicer酶mRNA的編碼區(qū)，抑制Dicer酶的表達(dá)。白細(xì)胞介素-8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子由可能由miR-486調(diào)控，低表達(dá)miR-486蛋白的淋巴細(xì)胞可分泌更多的白細(xì)胞介素-8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，而白細(xì)胞介素-8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在供應(yīng)炎癥的形成過程中發(fā)揮重要作用。此外miR-486還可致使血管內(nèi)皮嚴(yán)重?fù)p傷，膠原組織暴露，組織因子釋放，刺激血小板附著和聚集，從而激活凝血反應(yīng)鏈，導(dǎo)致纖維蛋白及免疫球蛋白也應(yīng)激增高，形成高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)，終致血液黏滯性及凝固性增加而處于高凝狀態(tài)或血栓前狀態(tài)，進(jìn)一步誘發(fā)房顫[16]。

miR-150可通過阻斷蛋白激酶 B信號(hào)通路抑制心血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和集落形成，在急性心肌炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎中，miR-150表達(dá)降低，提示miR-150在此類疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用[17]。miR-150通過調(diào)控鉀離子通道及鈣離子水平來影響心肌細(xì)胞的電生理活動(dòng)。miR-150靶向作用于 PP2A 的催化和調(diào)節(jié)亞基并抑制其表達(dá)，引起舒張期 Ca2+峰及后除極發(fā)生改變，導(dǎo)致 Ca2+/Ca MKⅡ依賴性蘭尼堿受體2在S2814 位點(diǎn)和S2030 位點(diǎn)的磷酸化增加，容易誘發(fā)室性心律失常[18]。miR-150通過各種多功能蛋白、生長(zhǎng)因子信號(hào)、受體分子等參與細(xì)胞內(nèi)周期進(jìn)程的調(diào)控，并對(duì)細(xì)胞 DNA 的復(fù)制起始和增殖起到十分重要的作用。研究表明miR-150與胚胎的發(fā)育有關(guān)，能直接下調(diào)Nodal蛋白家族中的squint蛋白，還能調(diào)控Nodal蛋白的抑制劑letfy[19]。

本研究結(jié)果顯示，病例組miR-486、miR-150表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；病例組HDL-C水平低于對(duì)照組，TG、LDL-C水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；病例組LAD水平高于對(duì)照組，LVEF水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-486、miR-150與TG、HDL-C、LDL-C、LAD負(fù)相關(guān)關(guān)系明顯，與LVEF呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明非瓣膜病房顫患者血清中miR-486、miR-150水平降低，且miR-486、miR-150與TG、HDL-C、LDL-C、LAD呈負(fù)相關(guān)，與LVEF呈正相關(guān)，診斷非瓣膜病房顫時(shí)，miR-486、miR-150的AUC與LVEF相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,miR-486、miR-150的AUC均高于LAD 、TG、HDL-C、LDL-C，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則說明miR-486、miR-150診斷非瓣膜病房顫的AUC與LVEF相近，適合在臨床上推廣應(yīng)用。

綜上所述，非瓣膜病房顫患者血清中miR-486、miR-150水平降低，且miR-486、miR-150與TG、HDL-C、LDL-C、LAD呈負(fù)相關(guān)，與LVEF呈正相關(guān)，miR-486、miR-150診斷非瓣膜病房顫的AUC與LVEF相近，適合在臨床上推廣應(yīng)用。