高瑩瑩 唐秀鳳 李曉曦 陳宇恒 于 萍 劉仁慧

哮喘是以氣道慢性炎癥為特征的呼吸系統(tǒng)的常見(jiàn)疾病之一，目前發(fā)生率和致死率逐年上升，并在全世界范圍內(nèi)都嚴(yán)重威脅公眾健康[1]。哮喘治療的首選藥物糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GC)雖有強(qiáng)大的抗炎作用，但長(zhǎng)期或大劑量應(yīng)用卻容易造成嚴(yán)重的難以解決的不良反應(yīng)[2]。GC作為為甾體激素，發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制是結(jié)合胞質(zhì)內(nèi)的糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)程，合成相應(yīng)的發(fā)揮抗炎作用的蛋白質(zhì)[3]。胞質(zhì)內(nèi)GR在未被激活時(shí)結(jié)合2分子的熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)，使GR維持預(yù)備結(jié)合的狀態(tài)[4]。筆者在前期實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，淫羊藿女貞子合用地塞米松對(duì)卵蛋白誘導(dǎo)的哮喘大鼠能產(chǎn)生協(xié)同抗炎、下丘腦-垂體-腎上腺軸及提高GR的結(jié)合力，并證實(shí)中藥合用布地奈德氣道吸入緩解哮喘的機(jī)制與調(diào)整GR/HSP90的比值有關(guān)[5～7]。但對(duì)淫羊藿女貞子合用全身給藥的GC——地塞米松對(duì)GR/HSP90的影響作用尚未明確。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性 SD 大鼠，SPF 級(jí)，體重120±10g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

2.試劑與藥品：卵清白蛋白(美國(guó) Sigma公司，A5253-250G)，氫氧化鋁(北京化工廠，批號(hào)：20120028)，地塞米松磷酸鈉注射液(5毫克/支，國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號(hào)：H41020036)，HSP 90、GRα一抗，均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，GRβ一抗(biorbyt，E10827)；小鼠抗β-actin抗體、羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG、 DAB顯色液均購(gòu)自中杉金橋，RIPA裂解液(Solarbio，20150517)，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP(10mmol/L)、Ex TaqMix，均由寶生物工程(大連)有限公司提供，引物由上海生工有限公司合成。

3.儀器：402A超聲霧化器(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)，電泳槽(日本TaKaRa公司)，7500型PCR儀(美國(guó)ABI公司)，Chromo4熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)(韓國(guó)Korea Biotech公司)。

4.動(dòng)物分組及藥物制備方法：42只大鼠隨機(jī)分為7組，即正常組(N組)、模型組(A組)、地塞米松組(Dex組)、淫羊藿女貞子煎劑組(YN1組)、淫羊藿女貞子煎劑合地塞米松組(YN1&Dex組)、淫羊藿女貞子提取物組(YN2組)和淫羊藿女貞子提取物合地塞米松組(YN2&Dex組)，每組均為6只。淫羊藿女貞子煎液和淫羊藿女貞子提取物制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8,9]。

5.造模、給藥及取材：參考文獻(xiàn)[10]方法于實(shí)驗(yàn)第1～35天，除N組外，其他動(dòng)物進(jìn)行造模。Dex組、YN1組、YN1&Dex組、YN2組、YN2&Dex組的給藥方法同參考文獻(xiàn)[11]。第36天處死動(dòng)物，開(kāi)胸，取左肺組織，部分4%甲醛固定，其余液氮凍存。

6.檢測(cè)方法：免疫組化法(immunohistochemistry，IHC)及Western blot(WB)法檢測(cè)肺組織GRα、GRβ、HSP90的蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)大鼠的肺組織中GRα、GRβ以及HSP90的 mRNA的表達(dá)，具體檢測(cè)方法同前[4]。詳見(jiàn)表1。

表1 GRα、GRβ以及HSP90引物序列

結(jié) 果

1. 各組大鼠肺組織中GRα表達(dá)的比較：與正常組相比，模型組和地塞米松組的大鼠肺組織中GRα蛋白及mRNA表達(dá)量都明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01)；地塞米松組與模型組相比 GRα mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，淫羊藿女貞子單用及淫羊藿女貞子與地塞米松合用均能明顯上調(diào)GRα 蛋白(WB法檢測(cè))及mRNA表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。與地塞米松組比較，淫羊藿女貞子單用及淫羊藿女貞子與地塞米松合用仍能顯著上調(diào)GRα 蛋白(WB法檢測(cè))及mRNA表達(dá)(P<0.05或P<0.01，表2)。

表2 各組大鼠肺組織中GRα表達(dá)的比較

與N組比較，*P<0.05，**P<0.01；與A組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Dex組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

2.各組大鼠肺組織中GRβ 表達(dá)的比較：與正常組相比，模型組中GRβ 的mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)，地塞米松組GRβ 蛋白及mRNA量均明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，地塞米松組GRβ 蛋白的IOD值顯著上調(diào)(P<0.05)；淫羊藿女貞子提取物組GRβ 蛋白的陽(yáng)性面積值顯著降低(P<0.05)；中藥淫羊藿女貞子單用組以及淫羊藿女貞子與地塞米松合用組GRβ mRNA的表達(dá)均明顯降低(P均<0.01)。與地塞米松組比較，淫羊藿女貞子單用組及淫羊藿女貞子與地塞米松合用組的GRβ 蛋白表達(dá)的IOD值和 mRNA的表達(dá)都明顯降低(P均<0.01)，GRβ 蛋白表達(dá)的陽(yáng)性面積值淫羊藿女貞子提取物合地塞米松組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而WB法檢測(cè)GRβ 蛋白表達(dá)是淫羊藿女貞子與合地塞米松的兩個(gè)合用組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01，表3)。

表3 各組大鼠肺組織GRβ 表達(dá)的比較

與N組比較，*P<0.05，**P<0.01；與A組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Dex組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.各組大鼠肺組織中HSP90表達(dá)的比較：與正常組比較，模型組表達(dá)的HSP90蛋白和mRNA均明顯降低(P<0.01)；地塞米松組HSP90蛋白(IOD值及WB法檢測(cè))及mRNA表達(dá)也顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，地塞米松組各值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.01)；其余給藥組HSP90蛋白(陽(yáng)性面積值及WB法檢測(cè)值)及mRNA的表達(dá)均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與地塞米松組比較，淫羊藿女貞子單用及淫羊藿女貞子與地塞米松合用共4組均能顯著上調(diào)HSP90蛋白(WB法檢測(cè)值)及mRNA的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，淫羊藿女貞子提取物與地塞米松合用組對(duì)IHC法檢測(cè)的HSP90蛋白含量均明顯上調(diào)(P<0.05,表4)。

表4 各組大鼠肺組織HSP90表達(dá)的比較

與N組比較，*P<0.05，**P<0.01；與A組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Dex組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

4.各組大鼠肺組織GRα/GRβ的比較：與正常組比較，模型組及地塞米松組GRα/GRβ 比值在蛋白及mRNA水平均顯著降低(P均<0.01)。分別與模型組和地塞米松組比較，淫羊藿女貞子與地塞米松兩個(gè)合用組在蛋白及mRNA水平上均可上調(diào)GRα/GRβ比值(P<0.05或P<0.01,表5)。此外，相關(guān)分析結(jié)果顯示， GRα 與GRβ 在蛋白及mRNA水平的相關(guān)系數(shù)r值分別為-0.566(P=0.000)和-0.495(P=0.001)。

表5 各組大鼠肺組織GRα/GRβ的比較

與N組比較，*P<0.05，**P<0.01；與A組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Dex組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

5.各組大鼠肺組織GR亞型/HSP90的比較：與正常組比較，模型組GRα/HSP90在mRNA水平及HSP90/GRβ在蛋白水平均明顯降低(P均<0.01)；地塞米松組GRα/HSP90 在mRNA水平及GRβ/HSP90在蛋白及mRNA水平均顯著降低(P均<0.01)。分別與模型組及地塞米松組比較，淫羊藿和女貞子的單用、淫羊藿女貞子與地塞米松合用組均能調(diào)整GRα/HSP90、GRβ/HSP90在mRNA水平上的比值(P均<0.01)；淫羊藿女貞子與地塞米松合用組能顯著抑制GRβ/HSP90在蛋白水平的比值(P<0.05或P<0.01)。此外，相關(guān)分析結(jié)果顯示， HSP90與GRα 在蛋白及mRNA水平的r值分別為0.708(P=0.000)和0.535(P=0.000)；HSP90與GRβ 在蛋白及mRNA水平的r值分別為-0.476(P=0.004)和-0.368(P=0.019,表6)。

表6 各組大鼠肺組織HSP90/GR亞型的比較

與N組比較，*P<0.05，**P<0.01；與A組比較，#P<0.05，##P<0.01；與Dex組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

討 論

哮喘的發(fā)病機(jī)制與GR損傷有關(guān)，包括GR的數(shù)量下降、結(jié)構(gòu)缺陷以及基因表達(dá)調(diào)控的改變等[12]。而使用外源性GC，會(huì)使GR的缺陷更加嚴(yán)重，表現(xiàn)為哮喘患者對(duì)激素的反應(yīng)性下降。GR有兩種主要的亞型，GRα 和GRβ。GRα 可激活經(jīng)典激素效應(yīng)，而GRβ不直接與GC結(jié)合，而是與GRα 存在拮抗關(guān)系起作用[13]。GRβ表達(dá)的增加與GC敏感度降低有明確關(guān)系[14，15]。GC 抵抗的發(fā)生可能是與GRα 與GRβ 比值失衡有關(guān)[16]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型及地塞米松組GRα 蛋白和mRNA表達(dá)均明顯降低，哮喘模型組GRβ mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，地塞米松組GRβ 蛋白及mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)。哮喘大鼠經(jīng)地塞米松治療后GRβ蛋白表達(dá)的上調(diào)提示哮喘大鼠對(duì)激素作用的敏感度降低，可能增加了GC抵抗的發(fā)生。而哮喘大鼠被給予地塞米松合用淫羊藿女貞子煎液或提取物治療后，GRα 的表達(dá)明顯增加，且GRβ 的表達(dá)被抑制，調(diào)整GRα/GRβ 的比值，提示改善GR亞型的表達(dá)及GRα/GRβ的失衡狀態(tài)，可能是中藥提高哮喘大鼠對(duì)激素作用敏感度的部分機(jī)制。

熱休克蛋白HSP90是GR的分子伴侶，可以激活GR使其發(fā)揮作用。在正常情況下，HSP90可以改變GR的立體構(gòu)象，使GR形成能與GC結(jié)合的特異性構(gòu)象，從而使GR可與GC結(jié)合。也就是說(shuō)HSP90與GR的配體的結(jié)合域結(jié)合后，GR才能與GC高效聯(lián)結(jié)發(fā)揮作用。所以HSP90減少，會(huì)使GR上與GC結(jié)合的位點(diǎn)的立體結(jié)構(gòu)不能與GC特異性結(jié)合，雖然有證據(jù)表明不與HSP90結(jié)合的GR也可以接受GC刺激，但對(duì)于GC的敏感度是降低的[17]。

HSP90不僅是能使GR激活成可結(jié)合狀態(tài)使其順利發(fā)揮作用，即HSP90的存在可增加類(lèi)固醇激素的敏感度；另一方面在激活GR后，HSP90對(duì)GC的作用效果也起到調(diào)節(jié)作用 ，即當(dāng)HSP90與GR之比適當(dāng)時(shí)，可增加GC的作用效果；而HSP90與GR之比不在正常范圍內(nèi)則可以降低GC的作用效果。本研究數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，哮喘模型組HSP90的蛋白表達(dá)量和其mRNA表的達(dá)量均明顯下調(diào)，同時(shí)GRα與 HSP90 的mRNA量之比明顯降低，而GRβ/HSP90比值顯著升高。淫羊藿女貞子煎劑和水提物與地塞米松合用后，HSP90 表達(dá)顯著上調(diào)，GRα/HSP90 或GRβ/HSP90均有顯著的改善。提示中藥淫羊藿女貞子調(diào)整哮喘大鼠對(duì)GC作用的敏感度與上調(diào)HSP90 表達(dá)，調(diào)整GR亞型與HSP90的比值有關(guān)。