湯 思 周秀芳 胡 克 熊夢清 胡衛(wèi)華 董明林

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)是一種常見的睡眠呼吸障礙性疾病，主要病理生理特征是在夜間反復(fù)發(fā)生上氣道狹窄或塌陷、頻發(fā)間歇低氧和覺醒[1]。頦舌肌是上氣道主要的伸舌肌，吸氣時(shí)頦舌肌收縮能保持氣道開放，頦舌肌功能障礙是引起上氣道塌陷的重要原因，而舌下神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(hypoglossal motor nuclei，HMN)通過舌下神經(jīng)支配頦舌肌[2]。目前OSAS治療的金標(biāo)準(zhǔn)是持續(xù)正壓通氣，但患者的依從性不高(17%～54%),藥物治療一直受到重視，并有望成為治療新手段[3,4]。五羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在多種病理生理活動(dòng)中發(fā)揮作用。研究顯示慢性間歇低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)大鼠頦舌肌的放電活性受到外周不同劑量5-HT受體配體的影響，本研究擬探討中樞舌下神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核中 5-HT的濃度變化對(duì)CIH大鼠舌下神經(jīng)放電活性的影響[5]。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8 周齡 SPF 級(jí)雄性成年 Sprague-Dawley 大鼠30只，體重150～180g，購自湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將大鼠隨機(jī)分為常氧組和CIH 組，前者分為常氧對(duì)照組和生理鹽水組，后者分為CIH對(duì)照組、5-HT(1mmol/L)組、5-HT(10mmol/L)組、5-HT(100mmol/L)組。CIH組大鼠接受CIH處理，其中CIH對(duì)照組不注射任何試劑，5-HT(1mmol/L)組、5-HT(10mmol/L)組以及5-HT(100mmol/L)組分別在在HMN注射20μl相應(yīng)濃度5-HT溶液，再記錄舌下神經(jīng)放電活性。常氧組中的對(duì)照組不注射任何試劑，生理鹽水組則在HMN注射等量生理鹽水。所有實(shí)驗(yàn)均在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。

2.實(shí)驗(yàn)試劑：五羥色胺鹽酸鹽購自美國 Sigma-Aldrich 公司，用生理鹽水配置成1mmol/L、10mmol/L、100mmol/L 3個(gè)濃度備用。

3.CIH 動(dòng)物模型的建立：按照我們已建立的方法進(jìn)行[6]。CIH 組大鼠飼養(yǎng)于常壓間歇低氧動(dòng)物箱中進(jìn)行CIH處理，每一循環(huán)周期 90s，其中低氧 30s(FiO28%)，復(fù)氧 60s(FiO221%)，每天8h，連續(xù)4周。常氧組大鼠在相同時(shí)間段放入同等規(guī)格動(dòng)物箱內(nèi)，同等穩(wěn)定溫濕度條件，輸入空氣。正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行急性間歇低氧(acute intermittent hypoxia，AIH)處理，每次5min，連續(xù)3次。

4.HMN定位注射：根據(jù)Paxinos & Watson 圖譜查找SD大鼠HMN坐標(biāo)(顱骨下8.70mm、中線旁0.40mm、距前囟13.68mm)。大鼠以10%烏拉坦(10ml/kg) 腹腔注射麻醉后，進(jìn)行氣管插管和雙側(cè)迷走神經(jīng)離斷；俯臥位固定于腦立體定位儀上，縱向剪開頭皮，找到腦部前囪。標(biāo)記前囟的三軸坐標(biāo)后，用打孔鉆在顱骨標(biāo)記處打孔；最后根據(jù)記下的坐標(biāo)值再次移動(dòng)到定位點(diǎn)，通過微量注射器將相應(yīng)試劑注射到HMN。

5.舌下神經(jīng)分離及電信號(hào)記錄：按照我們已建立的方法進(jìn)行[7]。將大鼠仰臥放置于恒溫臺(tái)上，鈍性分離大鼠一側(cè)舌下神經(jīng)(與注射部位同側(cè))并立即浸泡于溫液體石蠟中，在玻璃分針的幫助下輕輕將舌下神經(jīng)懸掛于雙極銀電極上。以多導(dǎo)生理記錄儀(Power Lab)記錄和分析舌下神經(jīng)電信號(hào)，設(shè)置帶通100～10000Hz，時(shí)間常數(shù) 50ms。常氧組和CIH對(duì)照組在記錄舌下神經(jīng)放信號(hào)前均進(jìn)行AIH處理，不同劑量5-HT組在間歇缺氧和注射試劑后開始記錄。

6.腦組織切片 HE 染色：處死大鼠后用多聚甲醛灌流并取出腦組織，進(jìn)行包埋切片和 HE 染色。在電子顯微鏡下觀察 HMN 微量注射留下的痕跡，根據(jù)解剖位置確認(rèn)微量注射部位是否為 HMN。

結(jié) 果

1.腦定位注射部位組織學(xué):圖1為大鼠腦定位注射后的冠狀位切片HE染色，可見微量注射針從小腦進(jìn)入第四腦室和到達(dá)HMN的痕跡，借助大鼠腦定位圖譜可確定注射部位為HMN。

圖1 腦定位注射部位冠狀位切面(HE，×100)

2.常氧組舌下神經(jīng)放電活性比較:常氧對(duì)照組和生理鹽水組大鼠舌下神經(jīng)放電活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1、圖2、圖3)，60min時(shí)兩組大鼠舌下神經(jīng)放電振幅分別為25.53±2.29μV 和25.08±1.28μV，放電頻率分別為71.60±8.17Hz和70.40±4.98Hz，P均>0.05，提示在 HMN 注射生理鹽水對(duì)舌下神經(jīng)放電活性無明顯影響。

表1 各組舌下神經(jīng)放電振幅變化

與常氧對(duì)照組比較,*P=0.000;與CIH對(duì)照組比較,*P<0.05;與5-HT(1mmol/L)組比較,ΔP<0.05;與5-HT(10mmol/L)組比較,▲P<0.05

3.CIH 對(duì)照組與常氧對(duì)照組舌下神經(jīng)放電活性比較：常氧對(duì)照組大鼠在15min、30min、 45min和60min時(shí)舌下神經(jīng)放電振幅分別為25.58±2.41μV、25.78±1.68μV、24.60±3.38μV、25.53±2.29μV，CIH 對(duì)照組分別為36.97±2.02μV、38.27±3.26μV、33.74±3.53μV、35.49±6.85μV(表1、圖2)，后者在各時(shí)間點(diǎn)放電振幅均高于前者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。如圖3所示，CIH對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)的放電頻率均高于常氧對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。60min 整合圖(圖4)可見 CIH 對(duì)照組舌下神經(jīng)放電振幅明顯高于常氧對(duì)照組，表明 CIH 可誘導(dǎo)舌下神經(jīng)放電活性持續(xù)增強(qiáng)，時(shí)間可達(dá) 60min，呈易化現(xiàn)象。

圖2 各組舌下神經(jīng)放電振幅比較與常氧對(duì)照組比較,#P=0.000;與CIH對(duì)照組比較,*P<0.05;與5-HT(1mmol/L)組比較,ΔP<0.05;與5-HT(10mmol/L)組比較,▲P<0.05

圖3 各組舌下神經(jīng)放電頻率比較與常氧對(duì)照組比較，#P=0.000

圖4 各組舌下神經(jīng)放電活性的整合圖

4.HMN 中不同濃度 5-HT 對(duì) CIH 組大鼠舌下神經(jīng)放電活性的影響：CIH 組大鼠在 HMN 分別注射 20μl 不同濃度(1mmol/L、10mmol/L、100mmol/L)5-HT 后，舌下神經(jīng)放電活性均有增強(qiáng)，且放電振幅隨5-HT 濃度而逐漸增強(qiáng)(圖4)。如表1和圖2所示，不同組別大鼠在各時(shí)間點(diǎn)放電振幅依次增大，5-HT(1mmol/L)組大鼠舌下神經(jīng)放電振幅平均于 30min 時(shí)達(dá)峰，5-HT(10mmol/L)組平均于 22min 時(shí)達(dá)峰，5-HT(100mmol/L)組平均于 15min 時(shí)達(dá)峰。5-HT(10mmol/L)組和5-HT(100mmol/L)組的放電振幅均顯著高于 CIH 對(duì)照組(P<0.05)，但5-HT(1mmol/L)組與 CIH 對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5-HT(100mmol/L)組大鼠舌下神經(jīng)放電振幅均大于 5-HT(10mmol/L)組，但只在 15min和30min時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CIH 各組間舌下神經(jīng)放電頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠在經(jīng) CIH 處理后，舌下神經(jīng)放電振幅和放電頻率均高于常氧組，表明 CIH 可誘導(dǎo)舌下神經(jīng)放電活性的增強(qiáng)，且可持續(xù) 60min，呈現(xiàn)出一種神經(jīng)可塑性，這與以往的研究結(jié)果一致。同時(shí)，不少實(shí)驗(yàn)也證明，CIH 能逐步增強(qiáng)舌下神經(jīng)/上氣道肌肉、膈神經(jīng)/膈肌、頸動(dòng)脈竇神經(jīng)的放電反應(yīng)性。

對(duì)經(jīng) CIH 處理大鼠的 HMN 微量注射不同濃度(1mmol/L、10mmol/L、100mmol/L)的 5-HT 后發(fā)現(xiàn)，1mmol/L 5-HT 即能引起舌下神經(jīng)放電振幅改變，且放電振幅隨5-HT 的濃度增高而增強(qiáng)，表明在 HMN 注射 5-HT 可增強(qiáng)舌下神經(jīng)放電活性，且一定范圍內(nèi) 5-HT 劑量與舌下神經(jīng)放電活性呈量效關(guān)系。5-HT 是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，涉及許多功能，包括睡眠、情感、學(xué)習(xí)和記憶等。目前認(rèn)為 5-HT 也參與 OSAS 的發(fā)生，包括調(diào)節(jié)睡眠/覺醒周期和影響睡眠結(jié)構(gòu)、呼吸控制和頦舌肌收縮[9，10]。筆者在以前的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)外周 5-HT 能增強(qiáng)舌下神經(jīng)放電活性，且由 5-HT2A 受體激活的 PKC途徑介導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)筆者發(fā)現(xiàn)中樞HMN中的5-HT也調(diào)節(jié)舌下神經(jīng)的放電活性[11]。

諸多研究表明，間歇缺氧誘導(dǎo)的舌下神經(jīng)放電活性增強(qiáng)依賴 5-HT 系統(tǒng)。首先，5-HT 本身能興奮呼吸[12]。其次，CIH 能增加舌下神經(jīng)核尾部腹中側(cè) 5-HT 含量，其機(jī)制可能與 CIH 能使舌下神經(jīng)核中神經(jīng)纖維 5-HT 濃度增加有關(guān)，也可能與CIH 可致舌下神經(jīng)核產(chǎn)生新的 5-HT 末端膨大有關(guān)[13]。此外，間歇缺氧可刺激延髓中縫 5-HT 能神經(jīng)元，使相關(guān)呼吸運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元池釋放 5-HT[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CIH 可增強(qiáng)舌下神經(jīng)放電活性，增加 HMN 中5-HT 的濃度能導(dǎo)致舌下神經(jīng)放電活性進(jìn)一步增強(qiáng)，這與上述結(jié)果相一致。

但在本實(shí)驗(yàn)中，舌下神經(jīng)的放電頻率并沒有因5-HT 的濃度改變而改變，這可能與舌下神經(jīng)放電振幅和頻率是由不同的神經(jīng)機(jī)制控制有關(guān)。舌下神經(jīng)放電振幅由呼吸運(yùn)動(dòng)池控制，而放電頻率則由產(chǎn)生呼吸節(jié)律的腦干網(wǎng)絡(luò)或通向節(jié)律中心的傳入通路調(diào)控[15]。Berner等[16]發(fā)現(xiàn)頻率調(diào)控可能與 P 物質(zhì)相關(guān)，缺乏 P 物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠不出現(xiàn)頻率長時(shí)程易化現(xiàn)象。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì) CIH 大鼠 HMN 給予 5-HT 能增強(qiáng)舌下神經(jīng)的放電活性，提示 5-HT 可能有利于 OSAS 患者上氣道的開放，為藥物治療 OSAS提供了思路。