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        蘇博美利奴羊胚胎期WNT2基因的組織表達(dá)及其生物信息學(xué)預(yù)測分析

        2019-03-03 03:12:36楊雪梅田可川黃錫霞阿布來提蘇來曼陳華峰何軍敏趙冰茹徐新明付雪峰田月珍吳偉偉哈尼克孜吐拉甫杜建文
        新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年12期
        關(guān)鍵詞:研究

        楊雪梅,范 雪,田可川,黃錫霞,朱 樺,阿布來提·蘇來曼,陳華峰,何軍敏,趙冰茹,徐新明,付雪峰,田月珍,吳偉偉,哈尼克孜·吐拉甫,杜建文

        (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所,烏魯木齊 830011)

        0 引 言

        【研究意義】蘇博美利奴羊是通過系統(tǒng)選育而成的羊毛細(xì)度為17.0~19.0 μm精紡用超細(xì)毛羊新品種,該品種成年公羊和母羊肩胛部平均羊毛細(xì)度的最細(xì)記錄分別為16.42、17.85 μm[1]。羊毛的生長發(fā)育與毛囊的結(jié)構(gòu)和特性密切相關(guān),中國超細(xì)毛羊(甘肅型)在胎齡138 d時(shí),大部分初級毛囊與部分次級毛囊發(fā)育成熟[2]。而蘇博美利奴羊在胚胎期65 d,初級毛囊形成;在胚胎期85 d次級毛囊形成;在胚胎期105 d次級獲得性毛囊形成;在胚胎期135 d,毛囊基本成熟[3]?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】羊毛的品質(zhì)及其商業(yè)價(jià)值是由毛囊的結(jié)構(gòu)和特性決定,若想要提高羊毛的品質(zhì)及產(chǎn)量,要研究其毛囊的發(fā)生發(fā)育,增加與毛囊發(fā)育有關(guān)基因的功能了解,才能更好的提高羊毛的質(zhì)量與產(chǎn)量。在毛囊發(fā)育過程中,幾種分泌的信號分子家族涉及表皮和真皮之間的通信[4-5]。其中,WNT家族似乎是表皮早期發(fā)育的最早和最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[6]。WNT2基因是WNT家族的成員之一,與腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移[7]。有研究表明,WNT2基因在細(xì)胞的生長、增殖過程中起重要作用[8]。此外,F(xiàn)u J等[6]不僅確定了產(chǎn)生WNT的細(xì)胞類型,還揭示了在毛囊形態(tài)形成的不同階段WNT信號的高度調(diào)節(jié)動態(tài)。推測WNT2基因可能是綿羊毛囊發(fā)育的潛在關(guān)鍵基因?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在過去的幾年里,已經(jīng)對該品種進(jìn)行了毛囊結(jié)構(gòu)[3]、表達(dá)分析[9-10]及產(chǎn)毛性狀[11]的研究,調(diào)節(jié)羊毛生長的分子機(jī)理尚未完全了解。毛囊發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)研究、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測分析及生物信息學(xué)分析可能是闡明羊毛生長分子調(diào)控機(jī)制的另一種策略?!緮M解決的關(guān)鍵問題】采用qRT-PCR法對蘇博美利奴羊毛囊成熟時(shí)期WNT2基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行研究,使用PROMO軟件預(yù)測WNT2基因啟動子區(qū)域序列的轉(zhuǎn)錄因子,并用Cytoscape_v3.5.1軟件可視化,使用MEGA 7.0軟件分析WNT2基因啟動子區(qū)域序列的核苷酸組成成分及密碼子的偏好性,并且利用綿羊、山羊、牛、人等9個(gè)物種的WNT2基因的DNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。為了解蘇博美利奴羊WNT2基因的分子結(jié)構(gòu)和進(jìn)化特征奠定基礎(chǔ),進(jìn)一步揭示W(wǎng)NT2基因在羊毛性狀調(diào)控中的作用。

        1 材料與方法

        1.1 材 料

        1.1.1 試驗(yàn)動物

        從新疆科創(chuàng)繁育中心采集3只2周歲左右健康無病、體況均勻的經(jīng)產(chǎn)蘇博美利奴母羊(平均纖維直徑約17.73 μm)胚胎期135 d(毛囊成熟時(shí)期)左側(cè)肩胛部皮膚組織及心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織。將各組織樣本保存于液氮中,且均為3個(gè)生物信息學(xué)重復(fù)。

        1.1.2 主要試劑

        EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox購自ABM(加拿大)、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser購自TakaRa公司(日本)、DL 2000 DNA Marker與6×Loading Buffer購自上海生工生物工程有限公司。

        1.2 方 法

        1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

        取組織樣品50~100 mg于液氮中研磨,使用Trizol法對蘇博美利奴羊的7個(gè)組織樣品進(jìn)行總RNA的提取。使用核酸檢測儀檢測其濃度與純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性;將檢測合格的總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成。

        1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

        根據(jù)NCBI上公布的綿羊WNT2基因(GenBank NO. NM_001195319.1)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(GenBank NO. NM_001190390.1)的序列,利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),最后由上海生工生物工程有限公司合成。表1

        表1 引物信息Table 1 Primer information

        1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

        以cDNA為模板,對目的基因WNT2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為25 μL:2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL, cDNA 2 μL,ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 3 min,94℃ 30 s,63℃ 45 s,35個(gè)循環(huán),72℃ 5 min。隨機(jī)選擇4個(gè)PCR產(chǎn)物取2 μL與3 μL的6×Loading Buffer混勻,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠180 V電泳25min,以DL2000為Marker來標(biāo)記產(chǎn)物片段的大??;之后使用凝膠成像儀進(jìn)行照膠,若獲得的產(chǎn)物片段與預(yù)期片段大小一致,可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

        實(shí)時(shí)熒光定量PCR以蘇博美利奴羊不同組織反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行,反應(yīng)體系為20 μL:EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix 10 μL,上、下游引物各0.6 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s,95℃ 5 s,60℃ 30 s,95℃ 5 s,共40個(gè)循環(huán),65℃ 5 s,95℃ 5 s。每個(gè)樣品均為3個(gè)生物信息學(xué)重復(fù)。

        1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測、核苷酸組成及密碼子偏好性

        下載NCBI上公布的綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列,使用在線軟件PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/cgibin/promo_v3/promo/promoinit.cgi dirDB=TF_8.3)對該基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測,并用Cytoscape_v3.5.1軟件進(jìn)行可視化;使用MEGA 7.0軟件估計(jì)綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列的核苷酸組成及密碼子偏好性分析。

        1.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

        下載NCBI上公布的綿羊(Sheep)、山羊(Goat)、牛(Bos taurus)、人(Human)、馬(Horse)、豬(Pig)、恒河猴(Rhesus monkey)、北白頰長臂猿(Northern white-cheeked gibbon)、蘇門答臘猩猩(Sumatran orangutan)、兔(Rabbit)、家鼠(House Mouse)等11個(gè)物種的WNT2基因的DNA序列,使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行多序列比對,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        蘇博美利奴羊不同組織中目的基因WNT2基因與內(nèi)參基因GAPDH基因的相對表達(dá)量采用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算,ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因,ΔΔCt=ΔCt目的組-ΔCt對照組,并用SPSS 19.0軟件單因素方差分析中的Duncan′s多重比較對表達(dá)量結(jié)果進(jìn)行差異比較。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 PCR產(chǎn)物檢測

        研究表明,擴(kuò)增出來的片段是109 bp,與預(yù)期的大小相同,無非特異性擴(kuò)增的條帶,反應(yīng)體系合理,反轉(zhuǎn)錄的cDNA可以用于后續(xù)的試驗(yàn)。圖1

        注:M:DL2000 DNA Marker;1-4:WNT2基因

        2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

        研究表明,WNT2基因與GAPDH基因有且只有一個(gè)峰,WNT2基因的熔解溫度為84℃,GAPDH基因的熔解溫度為84.5℃,引物特異性強(qiáng)。圖2,圖3

        圖2 WNT2基因的擴(kuò)增曲線(A)、熔解曲線(B)及熔解峰(C)Fig.2 Amplification Curve(A), Melting Curve(B) and Melting Peak(C) of WNT2 Gene

        圖3 GAPDH基因的擴(kuò)增曲線(D)、熔解曲線(E)及熔解(F)Fig.3 Amplification Curve(D), Melting Curve(E) and Melting Peak(F) of GAPDH Gene

        2.3 WNT2基因在胚胎期135 d不同組織中的表達(dá)

        研究表明,皮膚的ΔCt值最小,將皮膚作為對照組進(jìn)行表達(dá)量的計(jì)算。WNT2基因在各組織中均有表達(dá),但表達(dá)量各不相同。WNT2基因在皮膚組織中的表達(dá)量極顯著的高于其他6個(gè)組織(P<0.01),且WNT2基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉6個(gè)組織之間表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。圖4

        注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

        2.4 轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測

        通過使用在線軟件PROMO對綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測分析,并用Cytoscape_v3.5.1軟件可視化,研究表明,共預(yù)測出101個(gè)與綿羊WNT2基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子與WNT2基因存在一定的調(diào)節(jié)關(guān)系,可能是正向調(diào)控,也可能是負(fù)向調(diào)控。圖5

        圖5 WNT2基因啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子Fig.5 Transcription factors in the promoter region of WNT2 gene

        圖6 核苷酸組成成分Fig.6 Nucleotide composition

        2.5 綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列核苷酸組成成分

        通過使用MEGA 7.0軟件分析了WNT2基因啟動子區(qū)域序列的核苷酸組成成分,研究表明,WNT2基因啟動子區(qū)域序列的4種堿基的所占比例大致相同,T為25.90%,C為24.90%,A為25.80%,G為23.30%。圖6

        2.6 綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列密碼子偏好性分析

        研究表明,共有667個(gè)密碼子在綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域,而編碼氨基酸的密碼子有644個(gè)。其中,AAA的數(shù)量最多,共有26個(gè),占總密碼子的3.9%;而CGU的數(shù)量最少,有2個(gè),占總密碼子的0.3%。RSCU值說明了同義密碼子的相對使用度,AUG與UGG的RSCU值為1,這兩個(gè)密碼子的使用不存在偏好性;CAG與UCU的RSCU值相對其他密碼子較大,分別為1.42和1.40,說明這兩個(gè)密碼子是使用相對較多的密碼子;而CCG與CGU的RSCU值相對其他密碼子較小,分別為0.41和0.23,這兩個(gè)密碼子是使用相對較少的密碼子。通過對密碼子的數(shù)量及RSCU值的分析發(fā)現(xiàn),密碼子數(shù)量與使用偏好性不存在直接的關(guān)系。表2

        研究表明,667個(gè)密碼子決定了20種氨基酸,而每一種氨基酸的所占比例各不相同。絲氨酸的由73個(gè)密碼子決定,而甲硫氨酸僅由5個(gè)密碼子決定。圖7

        圖7 密碼子決定氨基酸種類Fig.7 Types of amino acids determined by codons

        2.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹

        通過使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建了綿羊、山羊、牛、人、馬、豬、恒河猴、北白頰長臂猿、蘇門答臘猩猩、家鼠與兔等11個(gè)物種的WNT2基因的DNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹,由研究表明,家鼠和兔與其他9個(gè)物種進(jìn)化距離較遠(yuǎn),而這9個(gè)物種聚為了2個(gè)大的分支,綿羊、山羊、牛、馬、豬聚在一個(gè)大的進(jìn)化分支,而人、恒河猴、北白頰長臂猿、蘇門答臘猩猩聚在另一個(gè)大的進(jìn)化分支。圖8

        圖8 WNT2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic Tree of WNT2 Gene

        表2 綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列密碼子偏好性Table 2 Codon preference in the promoter region of sheep WNT2 gene

        3 討 論

        WNT信號通路參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等過程,以及鄰近細(xì)胞間的相互作用[12-13]。一些研究表明,WNT信號通路廣泛參與毛囊形態(tài)發(fā)生的各個(gè)環(huán)節(jié)[14],該通路對所有類型毛囊形態(tài)發(fā)生都是非常重要[15],尤其在毛囊發(fā)生的起始階段起到至關(guān)重要的作用[16]。根據(jù)以往的研究,已知毛發(fā)的生長發(fā)育受毛囊周期變化的調(diào)節(jié)[17]。WNT信號通路中的WNT2在毛囊形態(tài)發(fā)生中起到重要作用,調(diào)節(jié)毛發(fā)長度[18]。

        研究采用qRT-PCR法對蘇博美利奴羊毛囊成熟時(shí)期WNT2基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)WNT2基因在7個(gè)組織中均有表達(dá),而在皮膚組織中的表達(dá)量極顯著的高于其他6個(gè)組織(P<0.01)。已有報(bào)道證明WNT2基因在山羊各組織中均有表達(dá),但在胚胎期90 d時(shí),WNT2基因在肺臟中的表達(dá)量高于皮膚,而在心臟、肝臟及腎臟的表達(dá)量低于皮膚[19],與研究結(jié)果部分一致。可能是WNT2基因在不同品種羊皮膚組織中的表達(dá)量不同,也有可能是研究時(shí)期不同造成表達(dá)量不同。馮新宇[20]表明WNT2基因的表達(dá)下調(diào)會激活凋亡通路,造成細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步說明WNT2基因?qū)γ业纳L發(fā)育具有促進(jìn)作用。

        轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動子上特定的DNA序列結(jié)合以激活或抑制特定基因的表達(dá),研究通過對綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測,共預(yù)測出101個(gè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,與WNT2基因存在或正或負(fù)的調(diào)節(jié)關(guān)系,但具體調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究。通過對綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列的核苷酸組成成分分析發(fā)現(xiàn),4種堿基呈現(xiàn)均勻分布。對密碼子偏好性分布分析發(fā)現(xiàn),CAG與UCU是使用相對較多的密碼子,而啟動子區(qū)域的絲氨酸,由73個(gè)密碼子決定。在不同物種之間構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以揭示綿羊WNT2基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,發(fā)現(xiàn)山羊和綿羊之間的進(jìn)化關(guān)系比與其他動物進(jìn)行比較時(shí)更為接近,這與薛麗娜等[21]的研究結(jié)果一致。

        miRNA是轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子,也可能是表型調(diào)控的潛在位點(diǎn)[22]。一些miRNA在細(xì)胞分化和皮膚毛囊的增殖中起著關(guān)鍵作用,它們的靶基因在毛囊的周期性生長中起著重要作用。Chen Y等[23]表明miRNA對WNT2基因表達(dá)的調(diào)節(jié)可能依賴于轉(zhuǎn)錄降解,miR-125a通過影響WNT信號通路中基因的mRNA表達(dá)水平參與毛囊發(fā)育,如WNT2、β-連環(huán)蛋白1 (Catenin beta 1,CTNNB1)、淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子1 (Lymphoid Enhancer Binding Factor 1,LEF-1)及過氧化物酶體增殖物激活受體δ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Delta,PPARD)。WNT基因家族編碼大量分泌蛋白,作為信號蛋白在細(xì)胞間傳遞,使細(xì)胞分化。而研究結(jié)果表明WNT2基因在蘇博美利奴羊胚胎期135 d的表達(dá)量最高,說明WNT2基因編碼的WNT2蛋白可能在綿羊皮膚組織中大量存在。

        4 結(jié) 論

        WNT2基因在皮膚組織中的表達(dá)量極顯著高于心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及肌肉組織。在綿羊WNT2基因啟動子區(qū)域序列共預(yù)測出101個(gè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,4種堿基呈現(xiàn)均勻分布,CAG與UCU的是使用相對較多的密碼子,對WNT2基因的DNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)山羊和綿羊之間的進(jìn)化關(guān)系比與其他動物進(jìn)行比較時(shí)更為接近。

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