李家平，何 濤，袁紅瑛

(1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科,河南洛陽 471003；2.河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003)

近20年子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且逐漸向年輕人群邁進[1-3]，在歐美發(fā)達國家其發(fā)病率高居生殖系統(tǒng)腫瘤首位[4]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病原因，機制目前尚無明確定論，給治療帶來諸多困難。近年來人們認(rèn)為Wnt信號通路的上游分子糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)可能影響腫瘤細(xì)胞的形成、遷移和自我更新，起著促進細(xì)胞程序性死亡，限制細(xì)胞增殖，發(fā)揮負(fù)性調(diào)控行為[5-6]。SOKOLOSKY等[7]研究顯示GSK-3β在胃癌組織中陽性表達水平較正常胃組織明顯下調(diào)。E-鈣粘蛋白(E-cadherin)在正常微環(huán)境中起著維持細(xì)胞之間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，防止它們隨意遷移、黏附，其表達水平降低易導(dǎo)致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化事件發(fā)生。許多研究顯示E-cadherin下調(diào)與上皮腫瘤關(guān)系密切，在口腔癌[8]、乳腺癌等上皮癌中E-cadherin表達較正常組織明顯下調(diào)。腫瘤的形成、進展涉及微環(huán)境的變化和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變等繁雜的程序[9]，本研究試圖應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測GSK-3β和E-cadherin在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達情況，旨在分析該基因與子宮內(nèi)膜腺癌的關(guān)系，有助于子宮內(nèi)膜腺癌的治療，為臨床預(yù)后提供參考，現(xiàn)報道如下。

A:正常增殖期內(nèi)膜組(SP×200);B:子宮內(nèi)膜不典型增生組(SP×200)；C：子宮內(nèi)膜腺癌組(SP×100)

圖1 3組GSK-3β的表達

1 資料與方法

1.1一般資料 本試驗86例標(biāo)本來自2010年1月至2012年12月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科手術(shù)切除子宮內(nèi)膜組織，分為正常增殖期內(nèi)膜組(12例)，子宮內(nèi)膜不典型增生組(19例)和子宮內(nèi)膜腺癌組(55例)。采用免疫組織化學(xué)SP技術(shù)探測GSK-3β、E-cadherin在3組標(biāo)本中表達情況。參照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟規(guī)定的手術(shù)病理分期，18例Ⅲ～Ⅳ期和37例Ⅰ～Ⅱ期子宮內(nèi)膜腺癌標(biāo)本，其中17例淋巴結(jié)被癌細(xì)胞浸潤。納入標(biāo)本的患者術(shù)前未進行放化療、激素治療，且無其他惡性腫瘤，切除標(biāo)本被病理證實。納選標(biāo)本均按免疫組織化學(xué)試驗要求制作。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)SP法 試劑：兔抗人GSK-3β單克隆抗體(美國Abcam公司)，試驗濃度1∶200；兔抗人E-cadherin單克隆抗體(中國福建邁新公司)工作液，試驗依照免疫組織化學(xué)SP-0023試劑盒(美國ZYMED公司)說明書步驟進行。

1.2.2免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 GSK-3β陽性表達位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核,E-cadherin陽性表達位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)。依據(jù)著色深淺和陽性細(xì)胞比例分析評定，a是著色水平：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；b是陽性細(xì)胞比例：陰性為0分，<1/4為1分，1/4～3/4為2分，>3/4為3分；統(tǒng)計a+b之和：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，>4分為強陽性(+++)。本研究陽性等級依照+～+++標(biāo)準(zhǔn)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗或Fisher精準(zhǔn)性檢驗分析，Spearman秩和法進行相關(guān)性分析，Kaplan-meier法進行生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1GSK-3β和E-cadherin在子宮內(nèi)膜不同病變中的表達

2.1.1GSK-3β表達 3組均可見GSK-3β表達，陽性表達主要定位于細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為棕褐色、棕黃色、黃色，見圖1。GSK-3β在正常增殖期內(nèi)膜組、子宮內(nèi)膜不典型增生組、子宮內(nèi)膜腺癌組中陽性率分別為83.3%、78.9%、36.4%，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.640，P=0.000)。子宮內(nèi)膜不典型增生組GSK-3β表達水平較子宮內(nèi)膜腺癌組顯著增高(χ2=10.273，P=0.001)，較正常增殖期內(nèi)膜組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.00)，正常增殖期內(nèi)膜組GSK-3β表達水平較子宮內(nèi)膜腺癌組明顯增高(χ2=8.789，P=0.003)，見表1。

表1 GSK-3β在3組組織中的比較[n(%)]

2.1.2E-cadherin表達 3組均可見E-cadherin表達，陽性表達主要定位細(xì)胞膜，表現(xiàn)為棕褐色、棕黃色、黃色，見圖2。E-cadherin在正常增殖期子宮內(nèi)膜組、子宮內(nèi)膜不典型增生組、子宮內(nèi)膜腺癌組中陽性率分別為91.7%、73.7%、21.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=28.959，P=0.000)。子宮內(nèi)膜不典型增生組GSK-3β表達水平較子宮內(nèi)膜腺癌組顯著增高(χ2=16.669，P=0.000)，較正常增殖期內(nèi)膜組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.363)，正常增殖期內(nèi)膜組GSK-3β表達水平較子宮內(nèi)膜腺癌組顯著增高(χ2=18.333，P=0.000)，見表2。

A:正常增殖期內(nèi)膜組(SP×200);B:子宮內(nèi)膜不典型增生組(SP×200)；C：子宮內(nèi)膜腺癌組(SP×100)

圖2 3組E-cadherin的表達

2.2GSK-3β和E-cadherin的表達與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理特征的關(guān)系 GSK-3β在FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅲ～Ⅳ期、Ⅰ～Ⅱ期陽性表達率分別為16.7%，45.9%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。E-cadherin陽性表達率在低分化組、中分化組，高分化組分別為9.1%、9.4%、66.7%，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高分化組和中分化組比較及高分化組和低分化組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，中分化組和低分化組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨著腫瘤侵犯組織范圍的擴大，GSK-3β的陽性表達率明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);E-cadherin的陽性表達率減弱，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；隨著病理分級的增高，GSK-3β的陽性表達率減弱，而差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但E-cadherin的陽性表達率呈明顯減弱趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而GSK-3β和E-cadherin的表達與癌細(xì)胞浸潤子宮肌層深度、是否轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)、患者的年齡無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表3。

表3 GSK-3β和E-cadherin的表達和子宮內(nèi)膜腺癌的臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3子宮內(nèi)膜腺癌中GSK-3β和E-cadherin表達的關(guān)系 相關(guān)性采用Spearman等級分析顯示GSK-3β和E-cadherin表達呈正相關(guān)(r=0.516,P=0.000)，見表4。

2.4子宮內(nèi)膜腺癌中GSK-3β和E-cadherin蛋白表達與預(yù)后 納入55例子宮內(nèi)膜癌，從手術(shù)后病理證實日期開始至2017年12月，隨訪36例，中途有3例患者因其他疾病死亡，2例患者未復(fù)發(fā)。經(jīng)Log-rank檢驗，GSK-3β陽性表達組臨床預(yù)后較陰性組好，E-cadherin陽性表達組臨床預(yù)后較陰性組好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、4。

表4 GSK-3β和E-cadherin在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達水平關(guān)系(n)

圖4 E-cadherin的表達與子宮內(nèi)膜腺癌臨床預(yù)后的Kaplan-meier分析

3 討 論

Wnt/GSK-3β信號通路是用來調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞極性及控制細(xì)胞命運的基礎(chǔ)通路。通路關(guān)閉時，GSK-3β與相關(guān)蛋白形成復(fù)合物抑制β-catenin入細(xì)胞核，從而阻止了細(xì)胞的癌變過程。GSK-3β由于具有“β”折疊的N端和“α”螺旋的C端結(jié)構(gòu)域，因此擁有獨特的磷酸化，亞細(xì)胞定位和GSK-3β結(jié)合蛋白之間的相互影響，協(xié)助在體內(nèi)實現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控。磷酸化GSK-3β氨基端的絲氨酸(Ser9)導(dǎo)致其失活，Wnt等信號通路可磷酸化此位點，而磷酸化GSK-3β酪氨酸位點(Tyr216)導(dǎo)致其被激活。因此，GSK-3β與相關(guān)蛋白形成復(fù)合物后通過各個途徑或規(guī)避或促進腫瘤的形成。胡福清[10]研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β被激活可以抑制乳腺癌干細(xì)胞擴增，失活型GSK-3β可以導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的耐藥，同樣高表達持續(xù)激活型GSK-3β可以抑制乳腺癌的成瘤[11-13]；而梁爽爽[14]的研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β可抑制凋亡，認(rèn)為腫瘤中可能存在如下機制：GSK-3β過度表達促使Wnt/β連環(huán)蛋白通路下游信號分子WISP-1過度表達，進而使半胱天冬酶(caspase)-3表達受抑，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖。本研究表明GSK-3β在正常和不典型增生子宮內(nèi)膜呈高表達，而在子宮內(nèi)膜腺癌呈低表達，提示可能是在癌組織中GSK-3β氨基端的一個絲氨酸(Ser9)磷酸化后其活性被抑制，導(dǎo)致GSK-3β與相關(guān)蛋白形成的復(fù)合物崩解，β-catenin逃逸被磷酸化而在細(xì)胞質(zhì)集聚并入核，本研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌組織中，隨著分期增加，陽性表達逐漸降低；隨著病理分級的增高，淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，陽性表達有下降趨勢，進一步論證試驗的推測：入核后的β-catenin促進靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，提示GSK-3β的低表達在腫瘤進行性發(fā)展中，扮演重要生物學(xué)角色，預(yù)兆著腫瘤的侵襲力和惡性程度。但對于腫瘤早期診斷有局限性，可能需要擴大樣本量進一步進行研究驗證。

人類E-cadherin基因定位于16q22.1，主要分布于上皮細(xì)胞，與細(xì)胞骨架、β-catenin等連接形成復(fù)合體，與周圍的組織細(xì)胞相互辨別、黏附，形成特定的組織[5]，其表達降低易導(dǎo)致細(xì)胞剛性改變，進而變性、游走、定植，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲能力增強。在乳腺腫瘤、消化道腫瘤、泌尿系腫瘤中，E-cadherin基因的突變或減弱均被檢測到。本研究結(jié)果顯示E-cadherin在正常和非典型增生子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)高表達，而在子宮內(nèi)膜腺癌顯示低表達，隨著病理分級的增高呈明顯下降趨勢(P<0.05)，隨著浸入肌層深度的增加、腫瘤分期的增高和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，陽性表達也降低，更進一步驗證試驗推測：入核后的β-catenin結(jié)合LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子家族，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄因子反過來抑制E-cadherin表達，導(dǎo)致細(xì)胞膜E-cadherin降低，一方面降低細(xì)胞極性、黏附性，觸發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化事件，腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移；另一方面，與細(xì)胞膜上E-cadherin蛋白結(jié)合的β-catenin從細(xì)胞骨架蛋白肌動蛋白附著處游離，在細(xì)胞質(zhì)集聚，激活Wnt信號通路，進一步加劇上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。在本研究55例子宮內(nèi)膜癌中，GSK-3β和E-cadherin有10例共為陽性，33例共為陰性，說明它們在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展中有相互協(xié)同作用。Wnt/GSK-3β信號如何與E-cadherin黏附復(fù)合物相互作用知之甚少，仍然需要大量的研究進行論證闡釋，

綜上所述，GSK-3β和E-cadherin的低表達，可能相互促進β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定性并募集入核，一方面與相關(guān)蛋白相互作用規(guī)避細(xì)胞凋亡，另一方面結(jié)合E-cadherin啟動子部位的E-box，促使E-cadherin的功能減弱而觸發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，癌細(xì)胞逃逸監(jiān)管四處遷移增殖，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。本試驗采用Spearman等級相關(guān)分析，GSK-3β和E-cadherin表達呈正相關(guān)。通過隨訪觀察，采用Kaplan-meier分析，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌GSK-3β和E-cadherin陽性表達患者臨床預(yù)后較好而陰性表達者較差，兩者在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起著既獨立又協(xié)同的作用。通過手術(shù)后對標(biāo)本進行聯(lián)合檢測，有利于臨床醫(yī)生對腫瘤的生物學(xué)特性準(zhǔn)確判斷、指導(dǎo)治療和預(yù)后評估。