田煥平，吳海波，劉惠良，白世茹，王學(xué)超，杜榮品△

(1.河北省人民醫(yī)院心內(nèi)六科，石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)研究生院，石家莊 050000)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使血管狹窄或阻塞，常由不穩(wěn)定斑塊糜爛及破裂誘發(fā)，造成一過(guò)性或持續(xù)性阻塞，從而引起的心肌損傷或壞死[1]。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是一種炎癥性疾病，由粥樣硬化斑破裂，誘發(fā)局部血栓形成，出現(xiàn)心肌缺血綜合征[2-5]。微小RNA(microRNA，miRNA)能調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平后的基因翻譯[6]。miRNA的5′端的核苷酸能與靶miRNA 3′-UTR區(qū)域互補(bǔ)，對(duì)下游靶基因產(chǎn)生調(diào)控[7]。miR-132可通過(guò)阻斷蛋白激酶B(protein kinase B，PKB) 信號(hào)通路抑制心血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和集落形成[8]。miR-31對(duì)細(xì)胞 DNA 的復(fù)制起始和增殖具有重要作用[9]。本研究擬探討AMI并心力衰竭患者血清miR-132和miR-31水平及其臨床診斷的價(jià)值，并與傳統(tǒng)的AMI并心力衰竭評(píng)價(jià)指標(biāo)超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、N 末端 B 型利鈉肽原(NT-proBNP)進(jìn)行相關(guān)性分析，為AMI并心力衰竭的早期診斷及治療提供理論及實(shí)踐基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年7月至2016年8月河北省人民醫(yī)院心內(nèi)科確診的80例AMI患者為病例組，其中男40例，女40例，年齡43～73歲,平均(59.8±13.4)歲,其中ST段抬高型心肌梗死54例，非ST段抬高型心肌梗死26例。選取同期76例門(mén)診健康體檢者作為對(duì)照組，其中男36例，女40例，年齡46～70歲，平均(58.7±12.7)歲，對(duì)照組均無(wú)既往肺栓塞病史、惡性腫瘤、6周內(nèi)手術(shù)史、下肢外傷史、心功能不全、腦血管意外、長(zhǎng)期臥床等病史。所有對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者經(jīng)臨床癥狀、心電圖、冠狀動(dòng)脈造影明確診斷，符合《2010年急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》，以及符合《2012年非 ST 段抬高急性冠狀動(dòng)脈綜合征診斷和治療指南》的高?；颊?；(2)AMI發(fā)病小于24 h；(3)初中以上文化水平；(4)既往無(wú)精神障礙史，可自由交流和溝通；(5)有一定的生活自理能力，意識(shí)清晰。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕婦或近3個(gè)月有手術(shù)、創(chuàng)傷史；(2)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病以外的其他心臟?。?3)肝、腎功能不全者；(4)嚴(yán)重高血壓未控制(≥180/110 mm Hg)、心源性休克、糖尿病酮癥、呼吸道疾病、周?chē)苄约膊』蛩ㄈ约膊≌摺?/p>

1.2方法

1.2.1儀器及試劑 貝克曼AU-480全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)庫(kù)爾特公司)、德鐵HBS-1096B酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品)、miR-132、miR-31基因的表達(dá)測(cè)定采用μLtraSYBR One Step RNA PCR Kit(寶生物工程大連有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)、NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)、恒溫培養(yǎng)箱grp-9080(美國(guó)通用公司、超凈工作臺(tái)(上海恒躍醫(yī)療器械有限公司)。hs-CRP、NT-proBNP ELISA試劑盒購(gòu)于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司,三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒為Syemex-i2000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀、貝克曼AU-480全自動(dòng)生化分析儀原廠(chǎng)自帶試劑。

1.2.2實(shí)驗(yàn)步驟 病例組及對(duì)照組患者清晨空腹及肱靜脈抽血；取靜脈血10 mL置于無(wú)菌管中，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，分離血清，AU-480全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TG、HDL-C、LDL-C，德鐵HBS-1096B酶標(biāo)儀測(cè)定hs-CRP、NT-proBNP。剩余血清用于測(cè)定miR-132、miR-31基因的表達(dá)，參照GenBank數(shù)據(jù)獲取2個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)待測(cè)基因位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，按20 μL模板和 50 μL反應(yīng)液構(gòu)成 PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增程序:95 ℃ 5 min;93 ℃ 10 s，61 ℃ 30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，61 ℃時(shí)采集熒光，反應(yīng)體系為：5 μL 2×μL traSYBR One Step RT-qPCR Buffer、0.4 μL正向引物,10 μmol/L、0.4 μL反向引物,10 μmol/L、0.2 μL SuperEnzyme Mix、0.6 μL RNA Template、3.4 μL Rnase-Free Water。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)其表達(dá)水平，見(jiàn)表1。

表1 β-actin、miR-132、miR-31引物序列

2 結(jié) 果

2.1兩組一般情況比較 兩組在性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒、高血壓、高脂血癥等一般資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組一般情況比較

續(xù)表2 兩組一般情況比較

2.2兩組miR-132、miR-31指標(biāo)比較 病例組miR-132表達(dá)水平低于對(duì)照組，miR-31表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組miR-132、miR-31指標(biāo)比較

2.3兩組血脂指標(biāo)比較 病例組HDL-C水平低于對(duì)照組，TG、LDL-C水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 兩組血脂指標(biāo)比較

2.4兩組hs-CRP、NT-proBNP水平比較 病例組hs-CRP、NT-proBNP水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 兩組hs-CRP、NT-proBNP水平比較

2.5miR-132、miR-31與各指標(biāo)相關(guān)性分析 miR-132與HDL-C，miR-31與TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；miR-132與TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP，miR-31與HDL-C呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表6。

2.6ROC曲線(xiàn)及靈敏度、特異度分析 受試者工作特征曲線(xiàn)提示，miR-31+miR-132、miR-31、miR-132 ROC曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.832(0.799，0.893)，0.801(0.758，0.868)，0.793(0.735，0.852)；miR-31、miR-132兩者的AUC相近，皆小于miR-31+miR-132；miR-31、miR-132診斷急性心肌梗死并心力衰竭的靈敏度、特異度相近(χ2=1.219、1.695，P>0.05)，皆小于miR-31+miR-132(χ2=16.249、17.023，P<0.05)，均具有一定診斷準(zhǔn)確性，見(jiàn)表7、圖1。

表6 miR-132、miR-31與各指標(biāo)相關(guān)性分析

表7 ROC曲線(xiàn)及靈敏度、特異度分析

A:miR-31+miR-132;B:miR-31;C:miR-132

圖1 miR-31+miR-132、miR-31、miR-132的ROC曲線(xiàn)

3 討 論

miRNA是一種具有高度進(jìn)化保守性的非編碼小RNA，其在調(diào)控細(xì)胞的基因表達(dá)方面有極其重要的作用，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也扮演著重要的角色[10]。miRNA可通過(guò)與下游靶基因的3′-非翻譯區(qū)相結(jié)合，參與細(xì)胞增殖、分化、及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程[11]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-31蛋白可介導(dǎo)細(xì)胞的定向轉(zhuǎn)移和趨化性，并激活淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞上相應(yīng)的趨化因子受體[12]。遺傳基因?qū)W發(fā)現(xiàn)miR-31過(guò)表達(dá)是引發(fā)大部分自身性炎性反應(yīng)的主要原因，高度表達(dá)miR-31蛋白的淋巴細(xì)胞株增殖能力明顯高于野生株[13]。高表達(dá)miR-31蛋白的淋巴細(xì)胞可分泌更多的白細(xì)胞介素(IL)-8及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，而IL-8、VEGF在炎癥的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14-15]。此外miR-31還可致使血管內(nèi)皮嚴(yán)重?fù)p傷，膠原組織暴露，組織因子釋放，刺激血小板附著和聚集，從而激活凝血反應(yīng)鏈，導(dǎo)致纖維蛋白及免疫球蛋白也應(yīng)激增高，形成高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)，進(jìn)一步誘發(fā)AMI及心力衰竭的發(fā)生[16]。miR-132具有組織特異性，在癌癥、神經(jīng)退行性病變、免疫系統(tǒng)疾病中也發(fā)揮重要作用[17]；也可能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，參與內(nèi)皮細(xì)胞中脂肪的生成和膽固醇的合成[18]。miR-31的作用機(jī)制與miR-132相反，研究表明miR-31與胚胎的發(fā)育有關(guān)，能直接下調(diào)Nodal蛋白家族中的squint蛋白，還能調(diào)控Nodal蛋白的抑制劑letfy[19]。

目前與心力衰竭相關(guān)miRNA的表達(dá)及功能研究主要集中在動(dòng)物模型上，較少在臨床患者中研究。因此本研究設(shè)計(jì)從臨床角度探討心肌梗死后心力衰竭患者血清miR-31、miR-132的表達(dá)水平及其意義。本研究結(jié)果顯示，病例組miR-132表達(dá)水平低于對(duì)照組，而miR-31水平高于對(duì)照組；病例組HDL-C水平低于對(duì)照組，TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP水平均高于對(duì)照組，且兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-132與HDL-C及miR-31與TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP呈正相關(guān)；miR-132與TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP及miR-31與HDL-C呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；說(shuō)明AMI并心力衰竭患者血清miR-132水平降低，miR-31水平升高；診斷AMI并心力衰竭時(shí)，miR-31、miR-132兩者的AUC相近，皆小于miR-31+miR-132，且AUC均具有一定的診斷準(zhǔn)確性。說(shuō)明miR-132、miR-31及miR-31+miR-132對(duì)于AMI并心力衰竭有一定的診斷價(jià)值，以miR-31+miR-132組合最佳。

綜上所述，AMI并心力衰竭患者血清miR-132、miR-31與miR-31+miR-132具有一定的診斷價(jià)值，以miR-31+miR-132組合最佳。