何雪娟，唐 雯，楊艷梅，龐雅賢，許 蕊，劉明清

(滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北滄州 061001)

近年來，甲狀腺疾病發(fā)病率明顯上升[1-2]，如何預(yù)防及治療甲狀腺疾病成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前已知甲狀腺疾病的發(fā)生除了與年齡、性別、碘攝入量等有關(guān)外，還與遺傳因素、自身免疫、感染等因素相關(guān)，尤其是考慮到某些基因的多態(tài)性可能影響到機(jī)體對(duì)疾病易感性而受到研究者的重視。Toll樣受體4(TLR4)是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的原體識(shí)別受體，在介導(dǎo)免疫反應(yīng)及免疫相關(guān)的炎性反應(yīng)中起著重要的作用[3]。本研究旨在探討TLR4基因rs1927914位點(diǎn)多態(tài)性與Graves病(GD)、橋本甲狀腺炎(HT)和單純性甲狀腺腫(SG)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，為甲狀腺疾病高危人群的篩檢及診治提供有利的分子生物學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取2016年河北省滄州市居民甲狀腺疾病流行病學(xué)調(diào)查項(xiàng)目確診的部分病例為病例組研究對(duì)象，共納入GD患者94例(GD組)，其中男24例、女70例；HT患者54例(HT組)，其中男13例、女41例；SG患者56例(SG組)，其中男12例、女44例；選取當(dāng)?shù)嘏c病例組性別組成、年齡在±5歲范圍內(nèi)的健康人為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)GD組，根據(jù)臨床癥狀和甲狀腺功能亢進(jìn)的生化證實(shí)，包括彌漫性甲狀腺腫、高放射碘攝取和高甲狀腺素水平。(2)HT組，彌漫性對(duì)稱性甲狀腺腫大且質(zhì)韌，生化檢驗(yàn)甲狀腺功能減退，并有甲狀腺過氧化物酶自身抗體(TPOAb)，帶或不帶甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)。(3)SG組，甲狀腺?gòu)浡阅[大或結(jié)節(jié)性腫大，生化檢驗(yàn)甲狀腺功能正常，131I攝取率正常，血清TPOAb、TgAb陰性。(4)對(duì)照組，來自同期同地區(qū)社區(qū)健康人群，所有對(duì)照無急慢性疾病和炎癥，無免疫疾病家族史，與患者無親緣關(guān)系。本研究得到倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，每個(gè)研究對(duì)象均知情同意。各組與對(duì)照組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 研究對(duì)象的性別和年齡分布

1.2方法

1.2.1DNA提取 所有研究對(duì)象均抽取肘靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，24 h內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室。用血液基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit，北京，中國(guó))按說明書提取全基因組DNA。

1.2.2基因分型 采用限制片段內(nèi)切酶法(RFLP)確定TLR4基因rs1927914(C/T,C是野生型)的基因型。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(生工?Sangon Biotech)，上游引物：5′-ACG TCT AGT CTA GAG CAT CA-3′，下游引物5′-GGA GTC TAC AAG AGT TTG TG-3′。采用天根公司PCR試劑盒(2×Taq PCR MasterMix)和 TC-XP-G XP基因擴(kuò)增儀按照實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)行目標(biāo)基因片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：開始預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s、退火54 ℃ 30 s、72 ℃延伸1 min循環(huán)35次，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NsiⅠ(Thermo)消化、通過2.5%瓊脂糖凝膠電泳確定基因型。若等位基因?yàn)镃，則被酶切為2段；若為T，則不能被酶切。所以當(dāng)基因型為TT時(shí)，電泳顯示1條條帶，長(zhǎng)340 bp；若基因型為CC，顯示2條條帶，長(zhǎng)220、120 bp；若基因型為CT，顯示3條條帶，長(zhǎng)340、220、120 bp。為了證實(shí)方法的準(zhǔn)確度，抽取5%的標(biāo)本進(jìn)行基因片段測(cè)序(ABI PRISM 3730xl,測(cè)序試劑為BigDye terminator v3.1)，檢測(cè)結(jié)果一致率達(dá)100%；與基因庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)，序列相同。

2 結(jié) 果

2.1PCR產(chǎn)物酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果 PCR產(chǎn)物酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果，見圖1、2。

M:Marker；1：CC基因型；2、4：TC基因型；3、5、6：TT基因型

圖1 TLR4基因rs1927914位點(diǎn)酶切電泳圖

圖2 TLR4基因rs1927914位點(diǎn)T/C多態(tài)性測(cè)序結(jié)果

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) TLR4基因rs1927914位點(diǎn)多態(tài)性的等位基因和基因型頻率在所有受試者中都未偏離Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，本次研究人群具有群體代表性。

2.3基因型和等位基因的比較

2.3.1等位基因比較 TLR4基因rs1927914位點(diǎn)等位基因T和C，在GD組、HT組、SG組的分布，分別與對(duì)照組進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3.2基因型比較 TLR4基因rs1927914-T/C位點(diǎn)基因型(TT/TC/CC)在3種疾病中的分布，分別與對(duì)照組進(jìn)行比較，經(jīng)非條件Logistic回歸計(jì)算其相關(guān)性。采用共顯性、顯性和隱性模式分析，3者對(duì)基因型的賦值方法分別為(1、2、3)、(1、1、3)和(1、3、3)。結(jié)果顯示TLR4基因rs1927914位點(diǎn)在3種遺傳模式下與GD、HT均無關(guān)聯(lián)；而在該位點(diǎn)與SG的相關(guān)分析中，在隱性遺傳模式下顯示相關(guān)性，即TT基因型個(gè)體對(duì)SG的易感性顯著增加(隱性遺傳模式：OR=1.923，95%CI=1.025～3.609，P=0.040)，見表2～4。

表2 TLR4基因 rs1927914位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與GD關(guān)聯(lián)分析

表3 TLR4基因rs1927914位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與HI關(guān)聯(lián)分析

表4 TLR4基因rs1927914位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與SG關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

TLRs是一個(gè)介導(dǎo)天然免疫的跨膜信號(hào)傳遞受體家族，它通過識(shí)別病原相關(guān)的分子模式，激活受體后級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生相關(guān)的免疫應(yīng)答[4]。TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的首個(gè)TLR相關(guān)蛋白。人類TLR4基因位于染色體9q33.1，全長(zhǎng)11.6 kb，由4個(gè)外顯子組成，編碼800個(gè)氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，多態(tài)位點(diǎn)位于TLR4基因的啟動(dòng)子區(qū)域，推測(cè)其多態(tài)性可能影響到基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，進(jìn)而改變TLR4 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，使機(jī)體對(duì)有害環(huán)境因素的反應(yīng)產(chǎn)生變化，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

基于以上原因，有關(guān)TLR4基因rs1927914位點(diǎn)多態(tài)性與疾病的相關(guān)研究多有報(bào)道。徐翔等[5]探討了中國(guó)北方漢族人群TLR4基因多態(tài)性與大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死及腦動(dòng)脈粥樣硬化血管床選擇性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在中國(guó)北方漢族人中位點(diǎn)多態(tài)性與腦梗死相關(guān)，與血管床選擇性不相關(guān)。而梁寶云[6]的研究則發(fā)現(xiàn)TLR4基因位點(diǎn)可能對(duì)男性缺血性腦卒中具有保護(hù)作用。張麗菊[7]應(yīng)用1∶1匹配的病例對(duì)照研究，確定位點(diǎn)多態(tài)性與2型糖尿病之間無相關(guān)性。古聯(lián)等[8]在對(duì)TLR4基因rs1927914位點(diǎn)多態(tài)性與漢族男性中風(fēng)易感性的研究中，發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性相關(guān)結(jié)果。印度有關(guān)該位點(diǎn)與糖尿病足和糖尿病視網(wǎng)膜病變關(guān)系的研究表明，兩者之間無關(guān)聯(lián)[9-10]。有關(guān)該位點(diǎn)多態(tài)性與癌癥的研究也有報(bào)道，WENG等[11]收集了3 937例病例和7 382例對(duì)照關(guān)于TLR4基因多態(tài)性與浸潤(rùn)性前列腺癌相關(guān)的研究做了Meta分析，顯示出陰性結(jié)果。

甲狀腺疾病是一類環(huán)境因素、生活方式及多基因聯(lián)合作用的病因復(fù)雜疾病。GD、HT、SG在人群篩查中比較常見。目前認(rèn)為，這3種甲狀腺疾病的發(fā)生除了與碘的攝入、吸煙、感染等外部因素有關(guān)外，都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的遺傳特點(diǎn)。為了探討TLR4基因rs1927914位點(diǎn)多態(tài)性與甲狀腺疾病之間的關(guān)系，以河北省滄州市甲狀腺疾病調(diào)查人群為研究對(duì)象進(jìn)行本研究。河北省滄州市東面臨海，西接太行山，不同區(qū)域環(huán)境及飲食飲水中碘的差異很大，各地生活習(xí)慣也各有不同。本研究在研究對(duì)象的選擇中，不僅獲得了人群調(diào)查所得病例，同時(shí)在同地區(qū)同人群中選擇同性別且年齡相近的人群做對(duì)照，很好地平衡了影響甲狀腺疾病發(fā)生的一些外部條件，以突出單基因在疾病發(fā)生中的作用。

本研究未發(fā)現(xiàn)TLR4基因rs1927914-T/C位點(diǎn)多態(tài)性與GD和HT的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)，而在該基因位點(diǎn)突變與SG的基因型相關(guān)分析中，發(fā)現(xiàn)其隱性遺傳模型與疾病有關(guān)聯(lián)，即TT基因型與SG病變呈正相關(guān)。其研究穩(wěn)定性和作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。曾有研究報(bào)道有關(guān)感染與甲狀腺疾病發(fā)生的作用機(jī)制。劉奕婷等[12]報(bào)道幽門螺桿菌感染與自身免疫性甲狀腺炎存在相關(guān)性； MORI等[13]指出腸道內(nèi)菌群的失調(diào)可造成腸道免疫屏障受損，從而影響腸外免疫系統(tǒng)并參與HT的發(fā)生；DESAILLOUD等[14]認(rèn)為是高度同源病毒肽段通過分子模擬機(jī)制誘發(fā)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致TLRs激活機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫，從而損傷甲狀腺細(xì)胞。SANTANA等[15]觀察到TLR4基因rs1927914攜帶T等位基因，增加了血清中白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-17的水平，而IL-1β對(duì)于增強(qiáng)T細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)至關(guān)重要。因此，筆者推測(cè)rs1927914位點(diǎn)的多態(tài)性可能影響到某些重要的細(xì)胞因子的生產(chǎn)水平，進(jìn)而改變了免疫系統(tǒng)對(duì)感染等外界環(huán)境因素的反應(yīng)調(diào)控作用，從而影響到SG的發(fā)生。

盡管本研究發(fā)現(xiàn)了TLR4基因rs1927914位點(diǎn)多態(tài)性與SG相關(guān)，但本研究也存在一定的局限性?？紤]到甲狀腺疾病的發(fā)生還與地理環(huán)境、種族差異、遺傳異質(zhì)性等有關(guān)，也不能完全排除吸煙、喝酒等其他一些混雜因素的影響；此外，單核苷酸多態(tài)性與疾病在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的關(guān)聯(lián)和真正的因果聯(lián)系之間還有很長(zhǎng)的距離，仍需要了解基因如何參與復(fù)雜的人體免疫系統(tǒng)調(diào)控最終影響疾病的發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了TLR4基因rs1927914TT基因型與SG的相關(guān)性，提示該基因在該病發(fā)生中的重要性。目前有關(guān)TLR4基因rs1927914位點(diǎn)多態(tài)性與甲狀腺疾病相關(guān)性研究報(bào)道較少，需要進(jìn)一步通過不同群體進(jìn)行研究，來揭示基因突變?cè)诩膊“l(fā)生、發(fā)展中的作用及作用機(jī)制，為基于遺傳學(xué)背景的個(gè)性化治療和人群預(yù)防奠定基礎(chǔ)。