曾凱宏，王 元，鄧 波，余雪梅，宋 怡，周 雪，黃璐嬌

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，成都 610072；2.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，成都 610054)

本課題組前期研究結(jié)果表明，在糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)早期視網(wǎng)膜微血管病變之前即可檢測到視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞凋亡[1-3]。SILVA等[4]研究DR早期神經(jīng)細(xì)胞微小RNA(miRNA，miR)表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-29b在DR早期視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞凋亡中起重要作用。miR-29b通過轉(zhuǎn)錄因子特異蛋白1(SP1)參與DR早期視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞凋亡。白藜蘆醇是非黃酮類多酚化合物，近年發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對DR有防護(hù)效應(yīng)，白藜蘆醇可改善C57BL/6 DR小鼠視網(wǎng)膜血管滲漏、微血管周細(xì)胞丟失及上調(diào)表皮生長因子受體(VEGF)表達(dá)[5-7]，證實(shí)白藜蘆醇對DR晚期視網(wǎng)膜微血管病變有防護(hù)作用。最近，白藜蘆醇經(jīng)miR通路起作用的機(jī)制已被關(guān)注。本研究通過建立糖尿病大鼠動(dòng)物模型，研究白藜蘆醇對糖尿病早期大鼠視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞凋亡及視網(wǎng)膜組織中miR-29b和SP1表達(dá)的影響，為指導(dǎo)人們通過膳食途徑防治DR提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級成年Sprague-Dawley(SD)大鼠購于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.2試劑 白藜蘆醇純品、鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1糖尿病動(dòng)物模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，用STZ誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠動(dòng)物模型，臨用前用0.1 mol/L (pH 4.2) 的檸檬酸緩沖液配制成2% STZ溶液，按60 mg/kg一次性左下腹腔注射，注射后72 h檢測定性尿糖和血糖，用尿糖試紙測尿糖達(dá)(+++)以上，尾靜脈采血測血糖濃度大于16.7 mmol/L即為模型建立成功。將糖尿病大鼠分為3組：糖尿病未治療組，低劑量(5 mg·kg-1·d-1)白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組，高劑量(10 mg·kg-1·d-1)白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組。健康大鼠也分為3組：健康對照組，低劑量(5 mg·kg-1·d-1)白藜蘆醇干預(yù)健康對照組，高劑量(10 mg·kg-1·d-1)白藜蘆醇干預(yù)健康對照組，每組大鼠68只。所有大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)都可以自由獲取食物和水。每天監(jiān)測大鼠情況，每周從尾靜脈抽取血液，通過標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室方法測定血漿葡萄糖和果糖胺水平。

1.3.2TUNEL染色聯(lián)合免疫熒光標(biāo)記 摘眼球后立即在4%多聚甲醛中固定2 h。去除角膜和晶狀體，將剩余的眼杯置于相同的固定劑中4 h。使用試劑盒(TdT-FragEL DNA Fragmentation Detection Kit;Oncogene,Boston,MA)在7 μm視網(wǎng)膜切片上進(jìn)行TUNEL染色，然后用20 μg/mL蛋白酶K孵育，用TdT/dUTP反應(yīng)混合物在37 ℃孵育1 h進(jìn)行DNA片段標(biāo)記，然后使用PBS洗3次。用含有5%正常山羊血清的封閉緩沖液封閉1 h。將切片在封閉緩沖液中與兔抗大鼠SP1抗體(1∶1 000,美國Sigma公司)一起孵育1 h。在避光、室溫條件下孵二抗(1∶200,美國Chemicon International公司)40 min。進(jìn)一步?jīng)_洗后，用蓋玻片覆蓋切片。通過將切片暴露于DNA酶中進(jìn)行DNA斷裂的陽性對照實(shí)驗(yàn)，陰性對照省略了TdT/dUTP標(biāo)記混合物，導(dǎo)致無染色。在Olympus共激光共聚焦掃描顯微鏡中觀察切片。計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜內(nèi)核層(INL)中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。使用OpenLab軟件測量INL的面積。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)分析 qRT-PCR檢測miR-29b和SP1基因表達(dá)，分別設(shè)計(jì)miR-29b和SP1基因引物及TaqMan熒光探針(由大連寶生物公司合成)。引物序列為：miR-29b正向引物5′-CGT AGC ACC ATT TGA AAT CAG TGT T-3′，反向引物5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；SP1正向引物5′-AGG TGC ACC AGC TTC CAG GCC TG-3′，反向引物5′-CCA GGT CCA TGA AGG CCA AGT TG-3′；RPL13A正向引物5′-AAG CCT ACA AGA AAG TTT GCC TAT C-3′，反向引物5′-TGT TTC CGT AGC CTC ATG AGC-3′。用常規(guī)酚/氯仿法提取大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞(RMPs)的mRNA，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系25 μL：2×TaqMan University PCR混合液12.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，10 μmol/L TaqMan探針0.3 μL，100 ng/μL DNA 0.2 μL，同時(shí)設(shè)立內(nèi)對照RPL13A基因，反應(yīng)在ABI Prism 7000熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為：93 ℃ 2 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。采用低循環(huán)數(shù)(Ct)比較法計(jì)算目的基因的相對拷貝數(shù)與表達(dá)水平。

1.3.4Western blot分析 提取總蛋白，使用Bradford方法(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)測定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白(60 μg)在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離，然后電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Bio-Rad,USA)。通過將膜與5%脫脂奶在三乙醇胺緩沖鹽溶液(TBS)加0.1%吐溫(TBST)中孵育60 min來阻斷非特異性位點(diǎn)。然后分別用以下一抗SP1(1∶1 000,美國Sigma公司)、GAPDH(1∶2 000，美國Sigma公司)，4 ℃孵育過夜。洗滌后，將膜與辣根過氧化物酶(HRP)共軛二抗一同孵育60 min。使用Bandleader 3.0軟件通過光密度測定分析相對表達(dá)水平。然后將每個(gè)蛋白的光密度讀數(shù)計(jì)算用于歸一化的GAPDH強(qiáng)度讀數(shù)的比率。

2 結(jié) 果

2.1白藜蘆醇對糖尿病大鼠血漿葡萄糖和果糖胺水平的影響 糖尿病大鼠血漿葡萄糖和果糖胺水平與年齡匹配的健康對照組大鼠相比均顯著升高(P<0.05)；在所有時(shí)間點(diǎn)，白藜蘆醇(5、10 mg·kg-1·d-1)處理的糖尿病大鼠血漿葡萄糖和果糖胺水平均顯著低于糖尿病未治療組大鼠(P<0.05)；而經(jīng)白藜蘆醇(5、10 mg·kg-1·d-1)處理的健康大鼠的血漿葡萄糖和果糖胺水平較健康對照組大鼠未發(fā)生明顯改變(P>0.05)，見表1、2。

表1 白藜蘆醇對糖尿病大鼠血漿葡萄糖水平的影響

a：P<0.05，與健康對照組比較；b：P<0.05，與糖尿病未治療組比較

A～D：干預(yù)后1、3、5、7個(gè)月后TUNEL染色聯(lián)合SP1免疫熒光染色圖；E：視網(wǎng)膜INL中TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果；a:P<0.01，與糖尿病未治療組比較；b:P<0.05，與低劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組比較

圖1白藜蘆醇對DR大鼠細(xì)胞凋亡及SP1分布改變的影響

2.2白藜蘆醇對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響 在STZ誘導(dǎo)和白藜蘆醇治療后的1、3、5和7個(gè)月時(shí)，糖尿病未治療組和低、高劑量白藜蘆醇(5、10 mg·kg-1·d-1)干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜中均可觀察到TUNEL陽性信號(hào)，TUNEL陽性信號(hào)主要位于視網(wǎng)膜的INL。而在健康對照組和低、高劑量白藜蘆醇干預(yù)健康對照組大鼠視網(wǎng)膜中均未觀察到TUNEL陽性信號(hào)。與糖尿病未治療組相比，低、高劑量白藜蘆醇(5、10 mg·kg-1·d-1)干預(yù)糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜INL中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.01)。在研究的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，高劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組與低劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組比較，INL中TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著降低(P<0.05)，見圖1。

表2 白藜蘆醇對糖尿病大鼠血漿果糖胺水平的影響

a：P<0.05，與健康對照組比較；b：P<0.05，與糖尿病未治療組比較

A:干預(yù)后1個(gè)月；B:干預(yù)后3個(gè)月；C:干預(yù)后5個(gè)月；D:干預(yù)后7個(gè)月；a:P<0.01，與正常對照組比較；b：P<0.05，c：P<0.01，與糖尿病未治療組比較；d：P<0.05，與低劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組比較；1：健康對照組；2：低劑量白藜蘆醇干預(yù)健康對照組；3：高劑量白藜蘆醇干預(yù)健康對照組；4：糖尿病未治療組；5：低劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組；6：高劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組

圖2白藜蘆醇對DR大鼠miR-29b表達(dá)的影響

A:干預(yù)后1個(gè)月；B:干預(yù)后3個(gè)月；C:干預(yù)后5個(gè)月；D:干預(yù)后7個(gè)月；a:P<0.01，與正常對照組比較；b：P<0.01，與糖尿病未治療組比較；c:P<0.05，與低劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組比較;1：健康對照組；2：低劑量白藜蘆醇干預(yù)健康對照組；3：高劑量白藜蘆醇干預(yù)健康對照組；4：糖尿病未治療組；5：低劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組；6：高劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組

圖3白藜蘆醇對DR大鼠SP1 mRNA表達(dá)的影響

A：干預(yù)后1個(gè)月；B：干預(yù)后3個(gè)月；C：干預(yù)后5個(gè)月；D：干預(yù)后7個(gè)月；a:P<0.01，與正常對照組比較；b：P<0.01，與糖尿病未治療組比較；c:P<0.05，與低劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組比較1：健康對照組；2：低劑量白藜蘆醇干預(yù)健康對照組；3：高劑量白藜蘆醇干預(yù)健康對照組；4：糖尿病未治療組；5：低劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組；6：高劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組

圖4白藜蘆醇對DR大鼠SP1蛋白表達(dá)改變的影響

2.3白藜蘆醇對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中miR-29b表達(dá)的影響 在干預(yù)后1、3、5和7個(gè)月，與健康對照組大鼠比較，糖尿病未治療組大鼠視網(wǎng)膜中miR-29b的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與未治療糖尿病組比較，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的低、高劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組miR-29b表達(dá)均上調(diào)至少1.2倍(P<0.05)。在4個(gè)研究時(shí)間點(diǎn)，高劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組的miR-29b表達(dá)水平均高于低劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組(P<0.05)；健康對照組大鼠視網(wǎng)膜中的miR-29b表達(dá)未被白藜蘆醇干預(yù)改變(P>0.05)，見圖2。

2.4白藜蘆醇對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中SP1表達(dá)的影響 在干預(yù)1，3，5和7個(gè)月后，與健康對照比較，糖尿病視網(wǎng)膜中SP1 mRNA表達(dá)分別增加2.1、2.2、2.3和2.3倍(P<0.01)；SP1蛋白表達(dá)分別增加2.0、2.1、2.1和2.1倍(P<0.01)。與未治療糖尿病組比較，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的低、高劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組SP1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，高劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組的SP1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于低劑量白藜蘆醇干預(yù)糖尿病組(P<0.01)。健康對照組大鼠視網(wǎng)膜中的SP1表達(dá)未被低、高劑量白藜蘆醇干預(yù)改變(P>0.05)，見圖3、4。

3 討 論

糖尿病發(fā)展成DR是一個(gè)緩慢的過程，一般需要5～6年的時(shí)間。糖尿病明確診斷、眼底出現(xiàn)改變之前的階段被稱作DR的臨床前期。研究發(fā)現(xiàn)，DR的臨床前期是先有視網(wǎng)膜組織代謝的損害，然后才是組織學(xué)或檢眼鏡下可見的血管異常。研究認(rèn)為，視網(wǎng)膜神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能異常出現(xiàn)最早。Muller細(xì)胞是視網(wǎng)膜的主要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。Muller細(xì)胞的功能是維持視網(wǎng)膜的穩(wěn)態(tài)和完整性。以往研究還發(fā)現(xiàn)，miR-29b的下調(diào)可能是DR誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷的主要因素[7]。本研究中，筆者在STZ注射后的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)都觀察到了視網(wǎng)膜miR-29b的下調(diào)表達(dá)。

目前國內(nèi)外關(guān)于DR防護(hù)的研究不勝枚舉，多數(shù)研究證明，高級糖基化終產(chǎn)物抑制劑、蛋白激酶C抑制劑、腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑及一些抗氧化劑等對DR有防護(hù)效應(yīng)，但對DR早期視網(wǎng)膜損傷防護(hù)效果不明顯[4-6]。白藜蘆醇具有很多生物學(xué)效應(yīng)，例如抗氧化、抗炎、抗癌、抗凝血和心臟保護(hù)作用[8-12]。迄今為止，已有大量研究證實(shí)白藜蘆醇對糖尿病和DR有保護(hù)效應(yīng)[13-16]，但白藜蘆醇對DR早期視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞損傷的作用如何尚未見報(bào)道。在本研究中，筆者觀察了白藜蘆醇抗DR誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞凋亡作用，結(jié)果表明，采用白藜蘆醇可有效抑制糖尿病大鼠血漿葡萄糖和果糖胺水平的升高，白藜蘆醇可有效地抑制體內(nèi)STZ誘導(dǎo)的INL中視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞胞體所在層的細(xì)胞凋亡。此外，本研究表明，糖尿病誘導(dǎo)的miR-29b下調(diào)和SP1上調(diào)可被白藜蘆醇抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明白藜蘆醇是DR的潛在治療選擇，miR-29b/SP1途徑可能在白藜蘆醇的抗凋亡機(jī)制中發(fā)揮作用。