吳晨燕，樊曉盼，李秀明，王 洋，馬儷珍,*

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384）

發(fā)酵牛肉調(diào)味基料（fermented beef flavoring，F(xiàn)BF）以冷凍牛胴體電鋸分割過(guò)程中產(chǎn)生的牛骨肉末為原料[1]，在傳統(tǒng)工藝（熱壓浸提、酶解、美拉德反應(yīng)）基礎(chǔ)上增加發(fā)酵工藝，此工藝制得的調(diào)味基料營(yíng)養(yǎng)豐富、賦香效果明顯，且具有很強(qiáng)的抗氧化性[2]，能夠明顯改善腌肉制品的風(fēng)味[3]，可廣泛應(yīng)用于肉制品加工中。通過(guò)乳酸菌發(fā)酵[4]提高FBF的抑菌性，使其在肉制品中的應(yīng)用前景更加廣闊。

乳酸菌的抑菌特性已被證實(shí)，學(xué)者們對(duì)乳酸菌的抑菌機(jī)制開(kāi)展了廣泛的研究[5-6]。乳酸菌的抑菌作用主要體現(xiàn)在兩方面：首先，乳酸菌能夠發(fā)酵糖類產(chǎn)生有機(jī)酸、雙乙酰、過(guò)氧化氫等多種代謝產(chǎn)物[7-8]，通過(guò)降低環(huán)境pH值和氧化還原電位，形成不利于有害菌的生存環(huán)境，抑制食品中病原菌和腐敗菌的生長(zhǎng)；另一方面，乳酸菌代謝產(chǎn)生的細(xì)菌素能夠阻止病原菌在機(jī)體內(nèi)定植，提高宿主對(duì)外來(lái)菌的抵抗力[9]。FBF加工過(guò)程涉及到乳酸菌的熱滅活，研究表明，滅活乳酸菌對(duì)有害菌仍能起到很好的抑制作用。滅活乳酸菌通過(guò)自身與黏膜的吸附作用[10-11]可以抑制人和動(dòng)物體內(nèi)大腸埃希菌[12]、白色假絲酵母[13]等病原微生物的侵染，改善生物體內(nèi)腸道菌群的組成[14]，提高機(jī)體的非特異性免疫能力[15-16]。

前期實(shí)驗(yàn)中，本課題組以4 株商業(yè)復(fù)合菌薩科WBL-45（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳桿菌）、WBX-43（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌）、B0M-13（清酒乳桿菌）、THM-17（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌）為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)利用THM-17制得的FBF賦香效果最好，且對(duì)大腸桿菌有較好的抑制效果，為了驗(yàn)證和提高FBF的抑菌性，本研究將發(fā)酵劑擴(kuò)大到15 株復(fù)合或單株乳酸菌，研究FBF在不同發(fā)酵劑和工藝條件下的抑菌特性差異，以篩選出抑菌效果較好的發(fā)酵劑，應(yīng)用于FBF的生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

電鋸分割冷凍牛胴體時(shí)產(chǎn)生的牛骨肉末（骨、肉質(zhì)量比3∶7），由頂興（天津）食品科技發(fā)展有限公司提供。

1.1.2 菌種

THM-17（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌）、WBX43（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌）、VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌）、WBL-45（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳桿菌）、PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+類植物乳桿菌+清酒乳桿菌）、VBM-60（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+戊糖片球菌+乳酸片球菌）、SHI-59（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌） 意大利薩科公司；彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus，LC）、清酒乳桿菌1（Lactobacillus sake 1，LS1）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus，LPe） 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LPl）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，PP）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus，SX）、清酒乳桿菌2（Lactobacillus sake 2，LS2）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus，SC），從薩科商業(yè)復(fù)合菌中分離得到。上述菌粉于－18 ℃冷凍貯藏，商業(yè)復(fù)合菌粉使用前于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%葡萄糖的滅菌乳培養(yǎng)基中活化2 h；單菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃連續(xù)活化3 代，于4 ℃貯藏備用。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸桿菌（Escherichia coli）、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi B），由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。使用前接種于LB培養(yǎng)基，于37 ℃連續(xù)活化2～3 代，于4 ℃貯藏備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司。

LB培養(yǎng)基：蒸餾水1 L、酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g，NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.4 試劑

風(fēng)味蛋白酶（500 LAPU/g）、復(fù)合蛋白酶（1.5 AU/g）丹麥諾維信公司；木糖、葡萄糖、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、VB1頂興（天津）食品科技發(fā)展有限公司；酵母浸提物、胰蛋白胨、氯化鈉、氫氧化鈉 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy公司；恒溫振蕩搖床 香港Blue Pand公司；Friocell 22恒溫恒濕培養(yǎng)箱 艾力特國(guó)際貿(mào)易有限公司；3001-1339 VarioskanFlash酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)3 個(gè)處理組：1）CK組（熱壓浸提-酶解-美拉德反應(yīng)）；2）反應(yīng)Ⅰ組（熱壓浸提-酶解-發(fā)酵），在發(fā)酵環(huán)節(jié)分別接種15 種商業(yè)復(fù)合菌或單株菌，即THM-17、WBX-43、VHI-41、WBL-45、PRO-MIX5、VBM-60、SHI-59、LPl、PP、SX、LS1、SC、LC、LS2及LPe；3）反應(yīng)Ⅱ組（熱壓浸提-酶解-發(fā)酵-美拉德反應(yīng)），在反應(yīng)Ⅰ組的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行美拉德反應(yīng)。

所有處理均制備2 份。以P. aeruginoosa、E. coli、S. typhimurium、S. paratyphi B、S. aureus為目標(biāo)菌，將經(jīng)以上3 種處理制得的FBF作用于目標(biāo)菌液，通過(guò)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處的光密度（optical density，OD）（OD600nm），對(duì)其抑菌性進(jìn)行研究。

1.3.2 樣品制備

1.3.2.1 熱壓浸提

在250 mL三角燒瓶中，稱取23 g牛骨肉末和92 mL蒸餾水（牛骨肉末和蒸餾水的質(zhì)量比1∶4），攪拌后于高壓滅菌鍋中熱壓浸提，0.1 MPa、121 ℃條件下浸提4 h，以充分提取牛骨肉末中的蛋白質(zhì)[4]。此環(huán)節(jié)共制備62 瓶熱壓浸提液。

1.3.2.2 酶解

將62 瓶熱壓浸提液冷卻至室溫，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.06%的風(fēng)味蛋白酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03%的復(fù)合蛋白酶，于50 ℃搖床中同步酶解4.5 h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶20 min，冷卻至室溫，得到62 瓶酶解液。

1.3.2.3 發(fā)酵

取2 瓶酶解液作為CK組，不進(jìn)行發(fā)酵，直接進(jìn)行下一步的美拉德反應(yīng)。將其余60 瓶酶解液進(jìn)行發(fā)酵，在酶解液中接種活化好的發(fā)酵劑，7 種商業(yè)復(fù)合發(fā)酵劑依照產(chǎn)品推薦量添加，添加量為牛骨酶解液質(zhì)量的0.02%，8 種單菌接種量為106CFU/mL，每種發(fā)酵劑接種4 瓶，在30 ℃、130 r/min條件下振搖發(fā)酵16 h，發(fā)酵結(jié)束后沸水浴滅菌20 min，冷卻至室溫，此時(shí)取接種不同發(fā)酵劑的發(fā)酵液各2 瓶（30 瓶），作為反應(yīng)Ⅰ樣品，其余發(fā)酵液（30 瓶）繼續(xù)進(jìn)行美拉德反應(yīng)。

1.3.2.4 美拉德反應(yīng)

向2 瓶CK組酶解液和剩余30 瓶發(fā)酵液中分別添加1.2%木糖、1.2%葡萄糖、0.9%半胱氨酸、0.45%甘氨酸、0.45%丙氨酸和1.8% VB1，攪拌均勻后在110 ℃條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)60 min，冷卻得到2 瓶CK組和30 瓶反應(yīng)Ⅱ組樣品。

1.3.2.5 離心

所有樣品均在2 ℃、5 000×g條件下離心1 min，取上清液，4 ℃冷藏備用。

1.3.3 抑菌率測(cè)定

參考阮關(guān)強(qiáng)[17]的方法，并對(duì)其進(jìn)行修改。取活化好的E. coli懸濁液100 μL，用LB液體培養(yǎng)基定容至10 mL，使其細(xì)菌濃度達(dá)到107CFU/mL，備用；將10 μL經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后的樣液加入到無(wú)菌96孔板中，然后加入上述細(xì)菌濃度為107CFU/mL的細(xì)菌懸濁液90 μL，以100 μL菌懸液為陽(yáng)性對(duì)照，以100 μL LB液體培養(yǎng)基為100 μL菌懸液的空白對(duì)照，以10 μL樣液+90 μL LB液體培養(yǎng)基為10 μL樣液+90 μL菌懸液的空白對(duì)照，混合均勻后，在37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600nm。各樣品對(duì)E. coli的抑制率按照下式計(jì)算。

式中：ODLB為100 μL LB液體培養(yǎng)基的OD值；ODE.coli為100 μL E. coli菌懸液的OD值；ODLB+FBF為10 μL FBF+90 μL LB液體培養(yǎng)基的OD值；ODE.coli+FBF為10 μL FBF+90 μL E. coli菌懸液的OD值。

各樣品對(duì)P. aeruginoosa、S. typhimurium、S. paratyphi B和S. aureus目標(biāo)菌的抑制率實(shí)驗(yàn)操作及其抑制率計(jì)算方法同上。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Sigma Plot 10.0軟件繪圖，用Statistix 8.1軟件中的Tukey HSD進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。所有組別數(shù)據(jù)均測(cè)定5 次，去掉最大值和最小值后取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組FBF對(duì)S. aureus的抑制率

由圖1可知：CK組FBF未經(jīng)發(fā)酵，其對(duì)S. aureus的抑制效果較弱，抑制率僅為21%；而15 株發(fā)酵劑中，除了THM-17和WBX-43制得的FBF在反應(yīng)Ⅱ中對(duì)S. aureus的抑制率有所降低外，其他處理組FBF在反應(yīng)Ⅱ中對(duì)S. aureus的抑制率均明顯高于反應(yīng)Ⅰ。其中，WBL-45處理組FBF，不論是反應(yīng)Ⅰ樣品還是反應(yīng)Ⅱ樣品，對(duì)S. aureus的抑制率均高于其他處理組，反應(yīng)Ⅰ中該處理組FBF對(duì)S. aureus的抑制率為51%，反應(yīng)Ⅱ則上升至58%，抑菌效果較好。

2.2 不同處理組FBF對(duì)S. typhimurium的抑制率

由圖2可知，反應(yīng)Ⅰ和反應(yīng)Ⅱ制得的FBF對(duì)S. typhimurium的抑制率均優(yōu)于CK組。CK組FBF對(duì)S. typhimurium的抑制率為12%，增加了發(fā)酵處理的反應(yīng)Ⅰ制得的FBF對(duì)S. typhimurium的抑制率在30%～50%范圍內(nèi)，反應(yīng)Ⅱ在反應(yīng)Ⅰ的基礎(chǔ)上增加了美拉德反應(yīng)，F(xiàn)BF的抑制率多處于55%～70%范圍內(nèi)。其中，以LS2（清酒乳桿菌）為發(fā)酵劑制得的FBF在反應(yīng)Ⅰ和反應(yīng)Ⅱ 2 種體系中對(duì)S. typhimurium的抑制率分別為55%和85%，顯著高于其他處理組（P＜0.05）。此外，THM-17在反應(yīng)Ⅱ中抑菌性大大提高，經(jīng)THM-17發(fā)酵制得的FBF對(duì)S. typhimurium的抑制率從反應(yīng)Ⅰ中的33%上升至69%。

2.3 不同處理組FBF對(duì)P. aeruginoosa的抑制率

由圖3可知，F(xiàn)BF對(duì)P. aeruginoosa的抑制效果較弱，在3 種反應(yīng)體系中，CK組和反應(yīng)Ⅰ組制得的FBF對(duì)P. aeruginoosa不僅沒(méi)有抑制作用，反而能促進(jìn)P. aeruginoosa的生長(zhǎng)，采用LC（彎曲乳桿菌）發(fā)酵制得的FBF對(duì)P. aeruginoosa的促生長(zhǎng)率甚至可達(dá)97%。經(jīng)美拉德反應(yīng)后，F(xiàn)BF對(duì)P. aeruginoosa的抑制率才有所體現(xiàn)，其中對(duì)P. aeruginoosa抑制效果較好的是LPl（植物乳桿菌）（66%）和LS2（清酒乳桿菌）（50%）。

2.4 不同處理組FBF對(duì)E. coli的抑制率

由圖4可知，CK組對(duì)E. coli的抑制率為61%。整體來(lái)看，反應(yīng)Ⅱ組各樣品對(duì)E. coli的抑制率均比反應(yīng)Ⅰ組有大幅度提高，其中變化最大的是以LPe（戊糖乳桿菌）為發(fā)酵劑制得的FBF，抑制率由17%提高到81%，增幅377%。從15 種不同的發(fā)酵劑來(lái)看，反應(yīng)Ⅰ組FBF對(duì)E. coli的抑制率大多為40%～60%，反應(yīng)Ⅱ組FBF對(duì)E. coli的抑制率提高到70%～80%。反應(yīng)Ⅱ組各FBF中對(duì)E.coli抑制率最高的是以商業(yè)復(fù)合菌WBL-45為發(fā)酵劑制得的FBF，其對(duì)E.coli的抑制率可高達(dá)100%。

2.5 不同處理組FBF對(duì)S. paratyphi B的抑制率

由圖5可知，反應(yīng)Ⅱ制得的FBF抑菌效果顯著優(yōu)于反應(yīng)Ⅰ和CK組制得的FBF。CK組不僅對(duì)S. paratyphi B無(wú)抑制作用，反而能促進(jìn)該致病菌的生長(zhǎng)。反應(yīng)Ⅰ制得的FBF對(duì)S. paratyphi B的抑制率大多為25%～50%，其中抑制效果最好的是以SC（肉葡萄球菌）為發(fā)酵劑制得的FBF，其抑制率高達(dá)89%，以PP（戊糖片球菌）和SX（木糖葡糖球菌）為發(fā)酵劑制得的FBF對(duì)S. paratyphi B的抑制率也分別高達(dá)50%和58%。經(jīng)過(guò)美拉德反應(yīng)后的反應(yīng)Ⅱ組FBF對(duì)S. paratyphi B的抑制率大多上升至60%～80%，經(jīng)VBM-60發(fā)酵劑制得的FBF，其抑制率由反應(yīng)Ⅰ組中的26%上升至99%，是反應(yīng)Ⅱ組中對(duì)S. paratyphi B抑制效果最好的。

3 討 論

3.1 不同乳酸菌發(fā)酵處理組FBF的抑菌效果差異分析

在不同處理組FBF對(duì)5 株致病菌的抑菌差異研究中，復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵FBF的抑菌效果多優(yōu)于單菌。這是由于復(fù)合發(fā)酵劑在混合發(fā)酵時(shí)具有協(xié)同效應(yīng)，會(huì)通過(guò)各自的代謝產(chǎn)物互相促進(jìn)，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，擴(kuò)大抑菌范圍，從而提高抑菌效果[18]。本研究所用發(fā)酵劑主要為乳桿菌屬、片球菌屬及葡萄球菌屬三大類。處理篩選出的發(fā)酵劑主要有3 種：WBL-45（SX+SL+LS2）、VHI-41（SX+PP+LPl）及LS2。葡萄球菌可使蛋白質(zhì)和脂肪降解，尤其是肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌，它們作為肉品常用發(fā)酵劑，主要用于產(chǎn)香，可延緩肉制品酸敗，形成風(fēng)味和氣味[19]。乳球菌屬、片球菌屬在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生有機(jī)酸、過(guò)氧化氫及細(xì)菌素等活性物質(zhì)，抑制病原菌和腐敗菌的生長(zhǎng)[20-21]。研究表明，清酒乳桿菌素?zé)岱€(wěn)定性好[22]，可增大細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)類物質(zhì)外泄，從而引起細(xì)胞死亡[23]。

3.2 經(jīng)不同工藝環(huán)節(jié)處理所得FBF的抑菌效果差異分析

對(duì)不同處理組FBF在反應(yīng)Ⅰ和反應(yīng)Ⅱ中的抑菌效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)能提高FBF的抑菌性。目前，美拉德反應(yīng)的抑菌性已逐漸被人們認(rèn)識(shí)并應(yīng)用[17,24]。美拉德反應(yīng)后期會(huì)形成一種棕黑色物質(zhì)——類黑精[25-26]，這類物質(zhì)有一定的抗氧化、抗誘變功能，對(duì)某些微生物也具有較好的抑菌活性[27-28]；Kim等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在含有還原糖和胰蛋白胨的培養(yǎng)基中，部分菌的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，而培養(yǎng)基中額外添加美拉德反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致菌死亡。此外，不同發(fā)酵劑在反應(yīng)Ⅱ中的抑菌性存在差異，這是由于不同發(fā)酵劑生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中積累的代謝產(chǎn)物不同，因此即使FBF制作過(guò)程中僅發(fā)酵劑的種類存在差異，但其作為美拉德反應(yīng)的底物[30-31]，也會(huì)使FBF的抑菌效果存在較大差異。

3.2 發(fā)酵劑對(duì)不同致病菌的抑菌效果差異分析

本研究發(fā)現(xiàn)，同一發(fā)酵劑對(duì)不同致病菌的抑菌效果存在差異。通過(guò)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組FBF對(duì)P. aeruginoosa的抑制效果最差。一方面，可能是由于P. aeruginoosa為G－菌，而乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)G+菌（尤其是親緣性較近的細(xì)菌）的抑制作用更強(qiáng)[32]；另一方面，P. aeruginoosa具有分泌胞外多糖形成生物被膜的能力，對(duì)環(huán)境的耐受性較強(qiáng)[33]；同時(shí)，P. aeruginoosa能夠產(chǎn)生哌嗪類色素，這些色素對(duì)外界環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗能力[34]，而美拉德反應(yīng)在堿性條件下會(huì)產(chǎn)生大量的哌嗪類物質(zhì)[35]，P. aeruginoosa與FBF某些產(chǎn)物發(fā)生協(xié)同作用，從而促進(jìn)P. aeruginoosa的生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

反應(yīng)Ⅱ組（熱壓浸提-酶解-發(fā)酵-美拉德反應(yīng)）制得的FBF抑菌性最好，其次是反應(yīng)Ⅰ組（熱壓浸提-酶解-發(fā)酵）制得的FBF，而CK組（熱壓浸提-酶解-美拉德反應(yīng)）制得的FBF雖然也有一定的抑菌性，但在3 種處理中對(duì)致病菌的抑制效果最弱。在反應(yīng)Ⅱ組中：以WBL-45和清酒乳桿菌為發(fā)酵劑制得的FBF抑菌性較好；以WBL-45為發(fā)酵劑制得的FBF對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制率顯著高于其他處理組，分別為58%和100%（P＜0.05）；以清酒乳桿菌為發(fā)酵劑制得的FBF對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑制效果是所有處理組中最好的，抑制率可達(dá)85%，綜合來(lái)看，WBL-45和清酒乳桿菌是適合制備FBF的發(fā)酵劑，熱壓浸提-酶解-發(fā)酵-美拉德反應(yīng)工藝制得的FBF抑菌效果最好。