張書(shū)祥，何奇松，孔子榮，郭建剛，周慶安，黃勝斌，韓銀華，熊 毅*

(1．廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001)

【研究意義】豬繁殖與呼吸障礙綜合征(PRRS)俗稱(chēng)藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一種以母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等以及仔豬和育肥豬發(fā)生呼吸道為特征的傳染病[1]。高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征(HP-PRRS)，是由PRRSV變異而引起的一種急性、高傳染性、高致病性傳染病。20世紀(jì)90年代初豬繁殖與呼吸障礙綜合征在歐洲大爆發(fā)，一共造成了超過(guò)100萬(wàn)頭豬死亡[2-4]。高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征于2006年底傳入廣西，2007年底引起大爆發(fā)[5]。廣西地區(qū)近年來(lái)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展迅速，特別是貴港地區(qū)年出欄數(shù)穩(wěn)步上升，成為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展的重要組成板塊。開(kāi)展廣西貴港地區(qū)豬繁殖與呼吸障礙綜合征調(diào)查分析可為該地區(qū)豬繁殖與呼吸障礙綜合征的疫情控制、流行狀態(tài)、防治重點(diǎn)提供科學(xué)參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PRRSV是動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)成員，單股正鏈RNA，長(zhǎng)約15 kb，共有10個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[6]。20世紀(jì)國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究學(xué)者從豬病體內(nèi)分離出該病毒[7-9]，宋云義等[10]研究結(jié)果表明，舊的商品豬場(chǎng)種豬群藍(lán)耳病陽(yáng)性率為98.18 %，仔豬群陽(yáng)性率為78.65 %，而新建商品豬場(chǎng)種豬群藍(lán)耳病陽(yáng)性率為63.64 %,仔豬群陽(yáng)性率為9.52 %。2006年，豬繁殖與呼吸障礙綜合征在中國(guó)的10多個(gè)省(市，區(qū))檢測(cè)到，超過(guò)2百萬(wàn)頭感染，約40頭豬死亡[11]，彭紅[12]對(duì)湖南省桑植縣的578份血樣進(jìn)行了PRRSV抗原檢測(cè)，陽(yáng)性率為43.51 %；楊澤林]等[13對(duì)重慶市794份組織樣品進(jìn)行了HP-PRRSV檢測(cè)，陽(yáng)性率為85.1 %。任奕先[14]等對(duì)廣西桂林地區(qū)PRRS流行情況進(jìn)行調(diào)查，PRRS的陽(yáng)性率為22.9 %；HP-PRRSV在我國(guó)流行至今可以分為3階段：2006-2008年主要是美洲型(VR-2332)，全國(guó)各地區(qū)也在同一時(shí)期分離到的毒株序列比較雜亂；2009-2010年HP-PRRSV仍然以美洲型為主，致病性與VR-2332一致，傳染性都很強(qiáng)；2011年以后仍以高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒為主，同時(shí)有美洲型、高致病性、歐洲型3種毒株存在[15-16]。豬扁桃體是機(jī)體重要的免疫器官,具有抗細(xì)菌、抗病毒的防御功能，也是多種病原微生物侵襲、定居、復(fù)制的重要場(chǎng)所，采集豬扁桃體樣品，用于監(jiān)測(cè)、診斷常見(jiàn)疫病，具有很強(qiáng)的代表性，但目前研究報(bào)道較多是采集病死豬的扁桃體或組織病料進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)規(guī)模豬場(chǎng)臨床健康豬大量進(jìn)行活體采集扁桃體，再進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析的報(bào)道較少。【本研究切入點(diǎn)】采集豬活體扁桃體進(jìn)行檢測(cè)，能較全面及客觀的反映規(guī)模豬場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中病毒感染、潛伏、流行情況，并可根據(jù)監(jiān)測(cè)需求，多次進(jìn)行重復(fù)采樣監(jiān)測(cè)，極大提高檢測(cè)的時(shí)效性與準(zhǔn)確性，為臨床生產(chǎn)上制定科學(xué)、合理的疾病防控方案提供可靠數(shù)據(jù)分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)廣西貴港地區(qū)2017年P(guān)RRS的感染情況進(jìn)行調(diào)查與分析，以期為今后PRRS的深入研究及有效防控提供科學(xué)依據(jù)，為廣西地區(qū)PRRS的臨床診斷及疫苗的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源及陽(yáng)性對(duì)照

樣品來(lái)自廣西貴港地區(qū)111個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的1865份扁桃體；陽(yáng)性對(duì)照為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(HuN4-F112株)和豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(CH-1R株)，均購(gòu)自黑龍江省哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑

RNAprep pure Tissue Kit RNAprep pure核酸抽提試劑盒購(gòu)自TianGen公司、One Step RT-PCR Kit Ver.2購(gòu)自TaKaRa公司，6xLoading Buffer購(gòu)自TaKaRa公司，DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司，Ager Powder購(gòu)自Solarbio公司，Gelred購(gòu)自BIOTIUM公司，用Premier5、Oligo6等分子生物學(xué)分析軟件設(shè)計(jì)引物，引物均由TaKaRa公司合成。

1.3 樣品的制備

將采集的扁桃體放入無(wú)菌的離心管管中，加入高壓過(guò)的鋼珠和1 mL的滅菌生理鹽水，用研磨儀在27.0 Hz的頻率下研磨3 min，研磨后的樣品反復(fù)凍融3次后，10 000 r/min于冷凍離心機(jī)離心5 min，取上清于-40 ℃或-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA的抽提

根據(jù)TianGen公司的RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA的抽提，同時(shí)設(shè)置高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒與經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的陽(yáng)性對(duì)照，以及陰性對(duì)照。抽提RNA -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物的合成

參考VR-2332 ( GenBank No. AY-150564) 、CH-1a ( GenBank No. AY032626) 、JXA1( GenBank No. EF112445)設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)引物P1/P2, 所設(shè)計(jì)引物位于緊靠缺失90個(gè)核苷酸區(qū)域兩端的保守區(qū)。高致病性PRRSV株和經(jīng)典PRRSV 株的預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別約426和516 bp。上游引物P1：5′-GGC GACAATGTCCCT AAC-3′; 下游引物P2：5′-GATGGCTTGAGCTGAGTAT-3′。引物由TaKaRa公司合成。

1.6 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

RT-PCR的反應(yīng)體系以25 μl體系反應(yīng)進(jìn)行：體系內(nèi)試劑成分及試劑劑量分別為：PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1 μl、2×1 step Buffer 10 μl、RNase Free dH2O 8 μl、P1 0.5 μl、P2 0.5 μl、待檢RNA產(chǎn)物 5 μl。

反應(yīng)程序。第1步：反轉(zhuǎn)錄，42 ℃ 45 min,94 ℃ 5 min；第2步：PCR程序?yàn)?4 ℃ 40 s、56 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；第3步：72 ℃延伸10 min。

1.7 RT-PCR產(chǎn)物的鑒定

在1 %的瓊脂糖凝膠上用90 V電壓電泳30 min，紫外燈下觀察結(jié)果，拍照并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 HP-PRRSV與classic PRRSV基因的擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用一步法RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)1875份扁桃體樣品進(jìn)行PRRSV核酸檢測(cè)，若目的條帶出現(xiàn)在426 bp左右且與高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒陽(yáng)性對(duì)照條帶一致，判定為高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒陽(yáng)性；若目的條帶出現(xiàn)在516 bp左右且與經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒陽(yáng)性對(duì)照條帶一致，則判定為經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒陽(yáng)性；其余判定為陰性，其中擴(kuò)增的4份陽(yáng)性樣品電泳圖見(jiàn)圖1。

M：DL 2000 DNA marker; 1:HP-PRRSV 陽(yáng)性對(duì)照; 2:經(jīng)典PRRSV 陽(yáng)性對(duì)照;3:陰性對(duì)照;4:HP-PRRSV陽(yáng)性樣品;5、7、8: 經(jīng)典PRRSV陽(yáng)性樣品;6、9:陰性樣品圖1 HP-PRRSV與classic PRRSV基因擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.1 The electrophoresis results of HP-PRRSV and classic PRRSV gene amplification

2.2 規(guī)模豬場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果

從表1可見(jiàn)，在廣西貴港地區(qū)111個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的1865份扁桃體樣品中，25個(gè)豬場(chǎng)檢出92份豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，其中9個(gè)豬場(chǎng)檢測(cè)出24份高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，樣品陽(yáng)性率為1.29 %；18個(gè)豬場(chǎng)檢測(cè)出68份經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，樣品陽(yáng)性率為3.65 %；2個(gè)豬場(chǎng)同時(shí)檢測(cè)出高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒。在25個(gè)陽(yáng)性豬場(chǎng)中，感染高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒最高的豬場(chǎng)陽(yáng)性率為45.00 %；感染經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒最高的豬場(chǎng)陽(yáng)性率為75 %。

表1 檢測(cè)陽(yáng)性豬場(chǎng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of RT-PCR test in positive pig farm

表2 不同免疫狀況PRRS核酸檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of PRRS nucleic acid detection in different immune conditions

表3 不同地區(qū)PRRS核酸檢測(cè)表Table 3 PRRSV nucleic acid detection table in different regions

2.3 不同免疫狀況下PRRS核酸檢測(cè)結(jié)果

對(duì)采樣豬群的免疫背景進(jìn)行調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，免疫、未免疫、免疫不詳豬群的PRRSV陽(yáng)性率分別為7.45 %、1.15 %、4.05 %，場(chǎng)點(diǎn)陽(yáng)性率分別為20.69 %、5.26 %、25.00 %(表2)。其中，免疫后的豬場(chǎng)樣品陽(yáng)性率與場(chǎng)點(diǎn)陽(yáng)性率均顯著(P<0.05，下同)，高于未免疫的豬場(chǎng)。

2.4 不同區(qū)域PRRSV核酸檢測(cè)結(jié)果

對(duì)不同采樣地區(qū)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，貴港市周邊區(qū)域、桂平縣、平南縣的陽(yáng)性份數(shù)分別是61、28、3份，陽(yáng)性率分別是5.04 %、6.29 %、1.42 %(表3)?？梢?jiàn)桂平市PRRSV的陽(yáng)性率最高，貴港市PRRSV的陽(yáng)性率次之，平南縣PRRSV的陽(yáng)性率最低，說(shuō)明三大區(qū)域均不同程度受到PRRSV的感染，其中以桂平及貴港周邊區(qū)域較為嚴(yán)重，應(yīng)因地制宜，做出針對(duì)性的防控對(duì)策。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，在111個(gè)豬場(chǎng)中有2個(gè)豬場(chǎng)同時(shí)檢測(cè)出高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，說(shuō)明該地區(qū)豬場(chǎng)中存在有高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的混合感染。有關(guān)研究表明，感染豬群在受外界環(huán)境、氣候等因素的影響時(shí)，可導(dǎo)致豬群的應(yīng)激抗力或免疫力下降，使病毒毒力增強(qiáng)，同時(shí)在受強(qiáng)毒、野毒和其它病原微生物的攻擊，即可出現(xiàn)從單一病原體所致的多重感染或混合感染，因而生產(chǎn)上常見(jiàn)呼吸道并發(fā)病、繼發(fā)感染和混合感染的病例顯著上升[17-19]。疫苗使用不當(dāng)導(dǎo)致的疫苗毒反強(qiáng)以及野毒感染也可直接引起混合感染情況的發(fā)生[20-22]。

另外有9個(gè)豬場(chǎng)檢測(cè)出24份高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，場(chǎng)點(diǎn)陽(yáng)性率為8.10 %，樣品陽(yáng)性率為1.29 %，18個(gè)豬場(chǎng)檢測(cè)出68份經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，場(chǎng)點(diǎn)陽(yáng)性率為16.2 %，樣品陽(yáng)性率為3.65 %，感染經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒豬場(chǎng)的比例比感染高致病豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的比例高出很多，說(shuō)明貴港地區(qū)以經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的流行為主要趨勢(shì)。分析此結(jié)果原因有2點(diǎn)：①高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒對(duì)溫度較敏感，在外界環(huán)境的生存能力較弱，一般在37 ℃環(huán)境下3到24小時(shí)，或56 ℃環(huán)境下6 ～20 min病毒即可喪失活性；在4 ℃時(shí)，1周內(nèi)活性下降90 %；對(duì)pH敏感，當(dāng)pH值小于6或大于7.5時(shí)，其感染性很快喪失；當(dāng)pH 6.5～7.5時(shí)病毒穩(wěn)定[23]。所以貴港地區(qū)在HP-PRRS流行很少的大環(huán)境下這種趨勢(shì)在接下來(lái)可能仍會(huì)持續(xù)下去。②經(jīng)典型豬繁殖與呼吸障礙綜合征一旦感染后豬群是長(zhǎng)期帶毒或終生帶毒，致死率較低，帶毒豬可長(zhǎng)期作為傳染源存在，并且其生活的環(huán)境，豬舍、豬糞及污染的水源也都可以作為感染源，很容易將病毒通過(guò)這些渠道感染給其他易感豬群。貴港地區(qū)雖然仍以經(jīng)典豬繁殖與呼吸障礙綜合征流行為主要趨勢(shì)，但仍然要對(duì)高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征保持高度警惕。

本研究中PRRSV的樣品陽(yáng)性率相對(duì)較低，僅為4.93 %。這主要與檢測(cè)的樣品類(lèi)型有關(guān)，本研究的樣品均為活體采集自正常豬的扁桃體，而上述研究檢測(cè)的樣品多數(shù)為發(fā)病豬的組織樣品。發(fā)病豬在確診發(fā)病后進(jìn)行檢測(cè)，不能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)豬繁殖與呼吸障礙綜合征疫情的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與豬場(chǎng)實(shí)時(shí)發(fā)病情況，不能對(duì)接下來(lái)的疫情進(jìn)行合理的預(yù)測(cè)，不能對(duì)帶毒豬或處于潛伏期未發(fā)病豬的檢測(cè)，有一定的局限性?；铙w采集生豬扁桃體進(jìn)行檢測(cè)比較合理。因PRRSV感染豬群后首先在呼吸系統(tǒng)的鼻粘膜或上呼吸道大量的蓄積復(fù)制，之后進(jìn)入血液后通過(guò)血液循環(huán)擴(kuò)散至全身，并在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)增殖，扁桃體作為豬主要的免疫器官，在感染PRRSV后病毒會(huì)在扁桃體內(nèi)大量的復(fù)制，采集生豬扁桃體能夠?qū)λ袔Ф矩i進(jìn)行檢測(cè)，并不局限于發(fā)病豬，所以可以根據(jù)檢測(cè)結(jié)果了解豬繁殖與呼吸障礙綜合征在豬場(chǎng)內(nèi)的感染情況、潛伏情況、以及對(duì)整個(gè)地區(qū)的流行情況進(jìn)行分析，對(duì)接下來(lái)的疫情發(fā)展做出合理預(yù)測(cè)并及時(shí)采取措施。活體采集后第一時(shí)間檢測(cè)也大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

通過(guò)對(duì)貴港地區(qū)的貴港市周邊地區(qū)、桂平市、平南縣的陽(yáng)性情況統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，桂平市的陽(yáng)性率最高，達(dá)到了6.29 %，貴港市周邊地區(qū)陽(yáng)性率次之為5.04 %，這兩個(gè)地區(qū)都顯著高于平南縣1.42 %的陽(yáng)性率，提示桂平市及貴港周邊地區(qū)生豬養(yǎng)殖環(huán)節(jié)應(yīng)做好嚴(yán)格的引種控制，以及人員和運(yùn)輸工具出入控制，并加強(qiáng)生物安全管理及衛(wèi)生防疫工作。

在對(duì)2017年貴港地區(qū)豬繁殖與呼吸障礙綜合征的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)免疫豬群陽(yáng)性率為7.45 %，顯著高于未免疫組群的1.15 %，分析原因可能是目前對(duì)PRRS的防控仍以免疫接種為主，在免疫過(guò)程中疫苗的選擇不夠科學(xué)，不能良好的控制疫情的發(fā)生，滅活苗與弱毒苗在使用后可能引起的反強(qiáng)也會(huì)導(dǎo)致豬的感染，而且免疫接種不能徹底解決PRRSV的持續(xù)感染和帶毒問(wèn)題，所以注射疫苗后原有感染豬仍然可以檢測(cè)出陽(yáng)性，并持續(xù)作為傳染源，這也可能是導(dǎo)致本研究中免疫豬群的PRRSV陽(yáng)性率比非免疫豬群高的一個(gè)原因，另一方面可能是由于PRRS活疫苗的普遍、頻繁、不合理使用，導(dǎo)致該病越變復(fù)雜，成為豬場(chǎng)的“常在性”疫病。PRRSV在流行的過(guò)程中較容易發(fā)生變異，特別是HP-PRRSV的變異速度更快，對(duì)于豬繁殖與呼吸障礙綜合征疫情相對(duì)于穩(wěn)定的豬場(chǎng)，不推薦使用高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征弱毒苗。對(duì)PRRS的防控仍然以科學(xué)的豬場(chǎng)管理和適合的免疫機(jī)制為主，疫苗的選擇應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)丶柏i場(chǎng)的實(shí)際情況進(jìn)行。

4 結(jié) 論

廣西貴港地區(qū)豬群中PRRSV仍以經(jīng)典株流行為主要趨勢(shì)，免疫豬群PRRSV陽(yáng)性率高于未免疫豬群，桂平市及貴港周邊地區(qū)感染情況較平南縣更為嚴(yán)重。