王 謝，鄧虎軍，林超文，姚 莉，唐 甜，張建華*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南山地農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；3.郫都區(qū)環(huán)境保護(hù)局，四川 成都 611730)

【研究意義】蠶沙是由蠶糞、殘留的桑葉和蠶的脫皮等所組成，其中，蠶糞含氮量很高，尤以可溶性尿酸的含量最為豐富；殘桑含有大量的蛋白質(zhì)、纖維素、糖類和磷脂等，可溶糖高達(dá)4.72 %；蠶脫皮主要由蛋白質(zhì)所組成[1]。因其富含有機(jī)質(zhì)和礦質(zhì)養(yǎng)分，被認(rèn)為是生物有機(jī)肥的重要原料[2]，但蠶沙攜帶有大量致病性很強(qiáng)的病源微生物[3]，嚴(yán)重地威脅到家蠶的養(yǎng)殖和生產(chǎn)，因而蠶沙的無(wú)害化處理被認(rèn)為是蠶沙綜合利用的一個(gè)關(guān)鍵課題。為了抑制蠶的腸道微生物對(duì)蠶沙養(yǎng)分在外界環(huán)境中的有害自然發(fā)酵，減少蠶沙養(yǎng)分的消耗，防止還有微生物生長(zhǎng)分泌有毒副作用物質(zhì)，控制蠶病病原微生物的擴(kuò)散，可利用物理或化學(xué)的方法殺死或除去蠶沙物料中一切有生物物質(zhì)，其中濕熱滅菌技術(shù)為常用的滅菌方法?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】濕熱滅菌法是指利用飽和蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。由于蒸汽具有很強(qiáng)的穿透能力，在冷凝時(shí)會(huì)釋放大量的冷凝熱，可使得生物體內(nèi)一些重要的蛋白質(zhì)，如酶類，發(fā)生凝固、形變，導(dǎo)致微生物無(wú)法生存而死亡[4]。當(dāng)前，蠶沙還田的研究主要針對(duì)堆肥處理的蠶沙[5]，對(duì)于濕熱滅菌無(wú)害化處理的蠶沙研究上屬于空白。【本研究切入點(diǎn)】本文研究濕熱滅菌蠶沙還田對(duì)該部分研究作為適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量交換的重要樞紐,是衡量植被恢復(fù)效益好壞的敏感指標(biāo)，能較早地指示土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的變化[6]。鑒于蠶沙本身對(duì)土壤所具有的潛在培肥能力，本研究希望在排除自身攜帶外源微生物條件下?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明確土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)于蠶沙養(yǎng)分資源的快速響應(yīng)狀況，以揭示土壤微生物對(duì)蠶沙還田的協(xié)同響應(yīng)狀況，為蠶區(qū)土壤生態(tài)系統(tǒng)功能穩(wěn)定性的維持提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 供試土壤 供試土壤為過(guò)2 mm篩的風(fēng)干土，土壤類型為紅棕紫泥土，采至四川省資陽(yáng)市雁江區(qū)坡耕地，土壤采集地?zé)o養(yǎng)蠶歷史。土壤的pH平均值為8.8，有機(jī)質(zhì)平均含量16.52 g/kg，全氮平均含量1.22 g/kg，堿解氮平均含量77.11 mg/kg，有效磷平均含量18.11 mg/kg，速效鉀平均含量177.00 mg/kg，陽(yáng)離子交換量23.77cmol(+)/kg。

1.1.2 供試蠶沙 供試蠶沙為無(wú)菌蠶沙，即利用手提式高壓滅菌鍋將有菌蠶沙在121 ℃下濕熱處理5 h后得到無(wú)菌蠶沙。其中，有菌蠶沙為2016年春蠶養(yǎng)殖后曬干的干蠶糞，來(lái)自四川省樂(lè)山市井研縣，以烘干基計(jì)算，該蠶沙含有機(jī)質(zhì)65.02 %、氮1.54 %、五氧化二磷0.41 %和氧化鉀2.89 %。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 室內(nèi)恒溫培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理：①供試土壤(CK，對(duì)照組)，不加蠶糞；②供試土壤+無(wú)菌蠶沙(SS，處理組)；各處理重復(fù)9次。實(shí)驗(yàn)時(shí)取滅菌的玻璃杯(高度13 cm，體積310 mL)，先杯子底部放入1 cm厚濕熱滅菌的棉花，再稱取150 g供試土壤，然后根據(jù)處理加入3 g供試蠶糞，再然后用無(wú)菌注射器加入50 mL無(wú)菌水，然后用保鮮膜封住杯口，并在保鮮膜上用注射器針頭均勻扎扎50個(gè)小孔，最后置于光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，培養(yǎng)時(shí)模擬白日溫度28 ℃、光照時(shí)間12 h，模擬黑夜溫度24 ℃、光照時(shí)間12 h。為保證培養(yǎng)條件一致，每天早上8點(diǎn)加水5 mL。

1.2 16s DNA測(cè)序與物種注釋

1.2.1 DNA提取及測(cè)序 準(zhǔn)確稱取0.1 g土樣，采用MoBio試劑盒法，提取土樣的總DNA。經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA完整性、MiniDorp測(cè)定DNA純度和濃度。將9份重復(fù)樣分為3組，每組3份。從每組的3份樣品中取等量樣品混勻，于-20 ℃保存、備用。對(duì)照組的3個(gè)重復(fù)分別命名為CK1、CK2和CK3；處理組的3個(gè)重復(fù)分別命名為SS1、SS2和SS3。參考Caporaso等[7]的方法，通過(guò)細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)段引物來(lái)擴(kuò)增各樣品，其引物為515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。DNA擴(kuò)增條件為98 ℃預(yù)變性1min，98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min[8]。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量，文庫(kù)合格后，使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.2.2 物種注釋 準(zhǔn)確稱取將所測(cè)得原始序列截去Barcode序列和引物序列，利用FLASH(V1.2.7)拼接[9]獲得原始Tags數(shù)據(jù)；利用Qiime(V1.7.0)軟件[10]過(guò)濾處理原始Tags數(shù)據(jù)獲得高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)，并與Gold database數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)并去除其中的嵌合體序列[11]，獲得有效數(shù)據(jù)。測(cè)序深度為每個(gè)文庫(kù)原始reaSS數(shù)不少于4萬(wàn)條，以97 %相似性為依據(jù)，利用UPARS Epipeline軟件將各序列聚類成為可執(zhí)行的分類操作單位(Operational taxonomic units，OTUs)。

1.2.3 物種多樣性統(tǒng)計(jì) 為獲得土壤樣品中微生物物種的多樣性信息，用Mothur方法與SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1.0)，統(tǒng)計(jì)界、門、綱、目、科、屬和種7個(gè)分類水平上的樣本的群落組成。使用PyNAST(V1.2)軟件與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的 "Core Set" 數(shù)據(jù)信息進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 α多樣性指數(shù)計(jì)算 使用Qiime(V1.7.0)軟件計(jì)算土壤樣本微生物群落α多樣性的相關(guān)指數(shù)，用Chao I指數(shù)和ACD指數(shù)表征菌群豐度，用Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)表征菌群多樣性，并利用R軟件對(duì)α多樣性指數(shù)進(jìn)行事后檢驗(yàn)。

1.3.2 群落結(jié)構(gòu)差異性分析 為揭示組件微生物群落結(jié)構(gòu)差異，并指明分類水平下組間的差異物種，首先利用R軟件做組間差異的多響應(yīng)排列分析[12](Multi Response Permutation Procedure of Within- versus Among-Group Dissimilarities，MRPP分析)；其次，利用R軟件用于進(jìn)行組間的T-test檢驗(yàn)，找出差異顯著(P<0.05)的物種；最后，采用組間群落差異分析[13](LDA Effect Size，LEfSe分析)方法，尋找處理組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker，并根據(jù)每個(gè)組分(物種)豐度對(duì)差異效果影響的大小(即為 LDA Score)繪制 LDA值分布柱狀圖，以展示了LDA Score大于4的物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 濕熱滅菌蠶沙還田對(duì)土壤OUT數(shù)目的影響

由圖1可知，SS和CK兩者共有的OTU為2427個(gè)，具有差異OUT為1623個(gè)。在差異的OTU中，60.26 %為CK獨(dú)有，39.74 %為SS獨(dú)有。從SS下的土壤微生物的OUT只有CK的90.22 %可知，濕熱滅菌蠶沙還田后會(huì)使得土壤細(xì)菌的種類減少。

2.2 濕熱滅菌蠶沙還田對(duì)土壤細(xì)菌群落α多樣性的影響

從圖2可知，CK和SS稀釋曲線最終均趨于平緩，表明本次測(cè)序量已基本覆蓋個(gè)樣品中的大多數(shù)細(xì)菌類群。SS中發(fā)現(xiàn)物種數(shù)目、Chao I指數(shù)和ACE指數(shù)分別為1801.50±19.09，1989.90±146.29和2058.92±133.9，分別只有CK的75.55 %、72.66 % 和75.4 %。SS處理下土壤細(xì)菌群落的Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)為8.16±0.17和0.9875±0.0049。由此可知，蠶糞丟棄物會(huì)降低土壤細(xì)菌群落的α多樣性。

CK：對(duì)照組；SS：處理組CK: Control group; SS: Treatment group圖1 OUTs韋恩圖Fig.1 OUTs venn diagram

CK：對(duì)照組；SS：處理組CK: Control group; SS: Treatment group圖2 樣品稀釋曲線圖Fig.2 Rarefaction curves of samples

Wilcox秩和檢驗(yàn)結(jié)果表示，CK和SS之間的Chao I指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)存在顯著的差異，其中，P值分別為0.047、0.030和0.033(P<0.05)。這表明濕熱滅菌蠶沙還田可以顯著地改變土壤細(xì)菌群落的α多樣性。

2.3 濕熱滅菌蠶沙還田對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群的影響

由表1可知，SS與CK之間的組間差異大于組內(nèi)差異(A>0)，這表明濕熱滅菌蠶沙還田對(duì)土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)具有一定的影響，但這種影響尚不顯著(表1，P=0.1)。

在門水平上，SS中相對(duì)豐富度排名前10的依次分別為變形菌門(46.38 %±6.09 %)、放線菌門(15.46 %±5.78 %)、擬桿菌門(14.51 %±1.27 %)、厚壁菌門(12.10 %±8.16 %)、酸桿菌門(3.39 %±1.68 %)、疣微菌門(2.14 %±0.66 %)、藍(lán)菌門(1.71 %±1.08 %)、芽單胞菌門(1.11 %±0.43 %)、浮霉菌門(1.03 %±0.08 %)和綠彎菌門(0.63 %±0.46 %)，其細(xì)菌的相對(duì)豐度分別是CK的0.94、2.53、1.33、5.04、0.29、0.57、2.51、0.20、0.45和0.31倍。

在綱水平上，SS中相對(duì)豐富度排名前10的依次分別為α-變形菌綱(18.57 %±7.37 %)、未鑒定的放線菌綱(13.91 %±4.47 %)、γ-變形菌綱(12.96 %±1.82 %)、β-變形菌綱(11.54 %±2.25 %)、鞘脂桿菌綱(8.37 %±2.11 %)、梭菌綱(6.56 %±5.70 %)、芽孢桿菌綱(4.26 %±2.50 %)、δ-變形菌綱(2.99 %±1.20 %)、未鑒定的酸桿菌綱(2.77 %±4.39 %)和未鑒定的芽單胞菌綱(1.11 %±1.61 %)，其細(xì)菌的相對(duì)豐度分別是CK的1.56、3.45、0.98、0.67、1.50、6.99、3.28、0.44、0.28和0.20倍。

表1 MRPP分析Table 1 Results of MRPP analysis

在目水平上，SS中相對(duì)豐富度排名前10的依次分別為黃色單胞菌目(9.98 %±2.10 %)、鞘脂桿菌目(8.37 %±2.11 %)、鏈霉菌目(8.29 %±4.77 %)、伯克氏菌目(7.83 %±2.48 %)、梭菌目(6.56 %±5.69 %)、根瘤菌目(5.230 %±1.03 %)、柄桿菌目(4.79 %±2.95 %)、紅螺菌目(4.32 %±3.04 %)、鞘脂單胞菌目(3.16 %±1.73 %)和Subgroup 6(1.27 %±2.97 %)，其細(xì)菌的相對(duì)豐度分別是CK的0.93、1.50、16.53、0.61、7.00、1.88、2.87、1.94、0.69和0.21倍。

在科水平上，SS中相對(duì)豐富度排名前10的依次分別為鏈霉菌科(8.29 %±4.77 %)、黃色單胞菌科(7.23 %±2.00 %)、噬幾丁質(zhì)菌科(6.25 %±1.87 %)、柄桿菌科(4.77 %±2.98 %)、叢毛單胞菌科(4.13 %±2.80 %)、紅螺菌科(3.00 %±2.85 %)、鞘脂單胞菌科(3.00 %±1.58 %)、毛螺菌科(2.70 %±2.49 %)、梭菌科(2.28 %±2.44 %)和芽單胞菌科(0.82 %±1.20 %)，其細(xì)菌的相對(duì)豐度分別是CK的16.63、0.87、1.51、3.15、0.46、2.86、0.72、13.08、6.80和0.21倍。

在屬水平上，SS中相對(duì)豐富度排名前10的依次分別為鏈霉菌屬(8.18 %±4.75 %)、短波單胞菌屬(3.58 %±2.58 %)、溶桿菌屬(3.54 %±2.20 %)、Flavisolibacter(1.81 %±0.68 %)、固氮螺菌屬(1.65 %±1.93 %)、珊瑚放線菌屬(1.24 %±0.23 %)、新鞘氨醇桿菌屬(0.69 %±0.21 %)、絲桿菌屬(0.63 %±0.18 %)、寡養(yǎng)單胞菌屬(0.57 %±0.26 %)和纖維微菌屬(0.27 %±0.07 %)，其細(xì)菌的相對(duì)豐度分別是CK的17.83、4.26、0.53、1.24、7.31、4.54、1.35、2.05、1.20和1.57倍。

對(duì)比SS和CK從門到屬5個(gè)等級(jí)的分類水平上細(xì)菌類群相對(duì)豐度排名前10的差異，不難發(fā)現(xiàn)，濕熱滅菌的蠶沙還田會(huì)影響土壤的優(yōu)勢(shì)種群。

2.4 處理組與對(duì)照組之間組間差異物種分析

組間的T-test檢驗(yàn)結(jié)果表明，在門水平有2個(gè)類群的細(xì)菌存在顯著差異(P<0.05)，在綱水平有10個(gè)類群的細(xì)菌存在顯著差異(P<0.05)，在目水平有16個(gè)類群的細(xì)菌存在顯著差異(P<0.05)，在科水平有43個(gè)類群的細(xì)菌存在顯著差異(P<0.05)，在屬水平有46個(gè)類群的細(xì)菌存在顯著差異(P<0.05)，在種水平有14個(gè)類群的細(xì)菌存在顯著差異(P<0.05)。在種水平上，SS中較CK的顯著增加細(xì)菌物種有10種(P<0.05)，分別為Shimazuellasp. 3-435、膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillusmucilaginosus)、黃色氫噬胞菌(Hydrogenophagaintermedia)、Chitinophagafiliformis、噬菌蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)、Shinellakummerowiae、黃褐粘球菌(Myxococcusfulvus)、Paenibacillusprovencensis和星形諾卡菌(Nocardiaasteroides)，其相對(duì)豐度較CK增加倍數(shù)分別為11.63、9.00、7.33、6.90、6.61、3.31、2.94和1.87。而SS較CK顯著減少的細(xì)菌物種有5種(P<0.05)，分別為GemmatimonadetesbacteriumLX87、uncultivated soil bacterium clone C002、AcidobacteriabacteriumWWH111、BacteriumWX65、Jahnellathaxteri，其相對(duì)豐度僅為CK的31.25 %、14.29 %、12.50 %、11.76 %和11.11 %。

2.5 濕熱滅菌蠶沙還田后土壤中的潛在生物標(biāo)記物

LEfSe分析結(jié)果(圖3)顯示，CK的特征細(xì)菌類群以酸桿菌門和芽單胞菌門為代表，而SS的特征細(xì)菌類群以放線菌、厚壁菌門和擬桿菌門為代表。其中，在綱水平上潛在指示濕熱滅菌蠶沙還田的標(biāo)記菌有未鑒定放線菌綱、梭菌綱、鞘脂桿菌綱、芽孢桿菌綱和黃桿菌綱5類；在目水平上潛在指示濕熱滅菌蠶沙還田的標(biāo)記菌有鏈霉菌目、梭菌目、芽孢桿菌目、鞘脂桿菌目、根瘤菌目和黃桿菌目6類；在科水平上潛在指示濕熱滅菌蠶沙還田的標(biāo)記菌有鏈霉菌科、毛螺旋菌科和噬幾丁質(zhì)菌科3類；在屬水平上潛在指示濕熱滅菌蠶沙還田的標(biāo)記菌有鏈霉菌屬、短波單胞菌屬和假黃單胞菌屬3類。從CK土壤的潛在生物標(biāo)記物中可以發(fā)現(xiàn)：濕熱滅菌蠶沙還田對(duì)土壤原有的噬纖維菌科、芽單胞菌科和叢毛單胞菌科3類細(xì)菌具有一定的抑制作用。

3 討 論

3.1 濕熱滅菌蠶沙還田后參與纖維素降解的主要細(xì)菌類群

濕熱滅菌蠶沙還田對(duì)土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)無(wú)顯著的影響這一結(jié)果暗示了測(cè)試土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，并彰顯出了其自修復(fù)能力。蠶沙濕熱滅菌后還田會(huì)向土壤中帶入了大量的未分解和半分解的纖維素，故而濕熱滅菌蠶沙還田后土壤細(xì)菌群落表現(xiàn)出的主要功能傾向?yàn)槔w維素降解。本研究結(jié)果顯示，濕熱滅菌蠶沙還田后土壤厚壁菌門和放線菌門細(xì)菌分別增加了5.04和2.5倍，而這兩大類細(xì)菌都是在纖維素降解中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位的細(xì)菌類群[14-16]。其中，厚壁菌門的梭菌目和放線菌門的鏈霉菌目最具代表性，本研究中濕熱滅菌蠶沙還田后梭菌目和鏈霉菌目細(xì)菌分別增加了7.00和16.53倍、梭菌科和鏈霉菌科細(xì)菌分別增加了6.80和16.63倍、鏈霉菌屬細(xì)菌增加了17.83倍；梭菌目下毛螺菌科細(xì)菌增加了13.08倍。

CK：對(duì)照組；SS：處理組CK: Control group; SS: Treatment group圖3 樣品中潛在生物標(biāo)記物分析(LDA>4)Fig.3 Analysis of potential biomarkers in samples (LDA>4)

厚壁菌門下毛螺菌科的細(xì)菌主要來(lái)源于動(dòng)物的腸道[17-19]，高鳳芹在研究?jī)煞N馴化瘤胃液的細(xì)菌物種多樣性時(shí)指出毛螺菌科細(xì)菌的增多可能有利于纖維素降解[20]。此外，厚壁菌綱下芽孢桿菌目也是一個(gè)不容忽略的重要細(xì)菌類群，不論從基礎(chǔ)研究還是應(yīng)用開(kāi)發(fā)都有很多的報(bào)道[21]。李康寧在研究渾善達(dá)克沙地生物土壤結(jié)皮纖維素降解細(xì)菌菌群時(shí)利用選擇性培養(yǎng)基篩選出的16株纖維素降解細(xì)菌中芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬相對(duì)豐度分別為43.8 %和25 %，為優(yōu)勢(shì)菌屬[22]。本研究也發(fā)現(xiàn)SS處理的土壤中在厚壁菌綱下芽孢桿菌目下的Shimazuellasp. 3-435、膠質(zhì)類芽孢桿菌(P.mucilaginosus)和P.provencensis比CK增加了11.63、9.00和2.94倍。劉欣利用木聚糖為唯一碳源篩選出一類芽孢桿菌(Paenibacillussp. E18)，經(jīng)底物特異性分析表明其對(duì)樺木木聚糖、大麥葡聚糖、地衣多糖、昆布多糖等具有較好的水解能力[23]。而與之相關(guān)的β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21;β-D-glucosidase)水解纖維二糖中的p-1,4-糖苷鍵，直接影響著纖維素的降解效率[24]。鑒于木聚糖是半纖維素中的代表性組分，是自然界中含量?jī)H次于纖維素的第二豐富的多聚糖[22]。認(rèn)為類芽孢桿菌屬的膠質(zhì)類芽孢桿菌(P.mucilaginosus)和P.provencensis細(xì)菌在濕熱滅菌蠶沙的降解中具有不可或缺的重要作用。

放線菌門下鏈霉菌科細(xì)菌作為典型的好氧纖維素降解菌，可通過(guò)分泌游離的纖維素酶協(xié)同降解纖維素[25]，在纖維素的降解功能上已經(jīng)十分明確[26-28]，本研究結(jié)果也與之相吻合，故此不再重復(fù)。

除了厚壁菌門和放線菌門外，變形菌門細(xì)菌在纖維素降解中也具有重要的作用。首先，在變形菌門下，本研究就發(fā)現(xiàn)短波單胞桿菌屬和固氮螺旋菌屬細(xì)菌增加了4.26和7.31倍，它們分屬于α-變形菌綱下的柄桿菌科和紅螺菌科；就短波單胞桿菌而言，它密切參與著纖維素的降解工作，羅立津等[29]在研究耐低溫木質(zhì)纖維素降解菌群時(shí)就支出該菌為25 ℃培養(yǎng)條件下的優(yōu)勢(shì)種群；而就固氮菌而言，蒲一濤等[30]就指出固氮菌和纖維素分解軍的混合培養(yǎng)可以加速生活垃圾的降解。其次，S.kummerowiae增加了3.31倍，它屬于β變形菌綱下紅環(huán)菌目、紅環(huán)菌科、Shinella屬，屬于Shinella根瘤菌家族成員；這暗示了濕熱滅菌蠶沙還田后在纖維素降解過(guò)程中會(huì)增加土壤部分有益微生物菌群，促進(jìn)礦質(zhì)養(yǎng)分的釋放[31]。再則，本研究結(jié)果還顯示假黃單胞菌屬可作為濕熱滅菌蠶沙還田后的潛在生物標(biāo)記物，而該菌在分類地位上也屬于變形菌門，從屬于γ-變形菌綱下的黃單胞菌科[32]，已經(jīng)被證明在在降解木質(zhì)纖維素上具有很高的研究和應(yīng)用價(jià)值[33-34]。

上述纖維素降解的優(yōu)勢(shì)菌群基本與當(dāng)前的研究結(jié)果相一致。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)擬桿菌門下鞘脂桿菌綱下泉發(fā)菌科噬幾丁質(zhì)菌屬下C.filiformis顯著增加了6.90倍，但目前對(duì)于該菌的生態(tài)功能研究相對(duì)較少，無(wú)所比較，鑒于幾丁質(zhì)本分就是β-1,4糖苷鍵連接的線性同源多聚體[35]，屬于土壤碳循環(huán)的重要部分[36]，故而本研究猜測(cè)該菌的存在可輔助纖維素降解。

3.2 濕熱滅菌蠶沙還田后噬菌蛭弧菌顯著增加

本研究中SS處理?xiàng)l件下噬菌蛭弧菌(B.bacteriovorus)的相對(duì)豐度較CK增加了6.61倍；該菌也屬于變形菌門，從屬于δ-變形菌綱、蛭弧菌目、蛭弧菌科、蛭弧菌屬，是1962年Stolp和Petzold等在土壤樣品中發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)菌的寄生菌，它廣泛存在于自然環(huán)境中[37]，如植物根際、河流、海洋、污水、腸和鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物糞便，甚至在牡蠣和螃蟹的鰓中[38]。而最重要的一點(diǎn)是該菌被認(rèn)為可能是環(huán)境自然凈化的因素之一[37]。噬菌蛭弧菌雖然不能利用碳水化合物，但它以不完全的三羧酸循環(huán)為主要代謝途徑，可以利用多肽及氨基酸作為能源和碳源，具有極強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力[39]。由于該菌對(duì)人體沒(méi)有危害，它不僅被用于污水處理，還被用于生物防治一些農(nóng)作物的病原菌[38]。

3.3 蠶沙濕熱滅菌后依然存在的環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)

本研究還發(fā)現(xiàn)放線菌亞綱下棒桿菌亞目下諾卡氏菌科的星形諾卡菌(N.asteroides)比CK增加了1.87倍。該菌廣泛分布于土壤等自然環(huán)境中，為腐物寄生菌，能引起人或動(dòng)物急性或慢性諾卡菌病[40]。苑美玉指出該菌可通過(guò)呼吸道引起人的原發(fā)性、化膿性肺部感染，出現(xiàn)肺結(jié)核的癥狀[41]。雖然該菌在蠶病中未見(jiàn)報(bào)道，但在浮游生物、甲殼類動(dòng)物、濾食性貝類、海龜?shù)昂汪~類中皆有發(fā)現(xiàn)[42-44]，故而建議加強(qiáng)養(yǎng)蠶環(huán)境條件下星形諾卡菌(N.asteroides)的研究，并適當(dāng)考慮在未來(lái)養(yǎng)蠶環(huán)境安全評(píng)估中將星形諾卡菌(N.asteroides)的相對(duì)豐度作為評(píng)估指標(biāo)之一。

4 結(jié) 論

土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和功能相對(duì)穩(wěn)定，濕熱滅菌蠶沙還田后會(huì)快速激活了與纖維素代謝相關(guān)的細(xì)菌類群，并通過(guò)增加這些細(xì)菌類群相對(duì)豐度的方式促進(jìn)土壤的自我修復(fù)。此外，噬菌蛭弧菌相對(duì)豐度的增加進(jìn)一步暗示了土壤的自凈能力。