曹 丹，金孝芳*，馬林龍，劉艷麗，郭桂義

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所，湖北 武漢 430064；2.信陽農(nóng)林學(xué)院/河南省豫南茶樹資源綜合開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽 464000)

【研究意義】硒是人和動(dòng)物必需的微量元素之一，過量或不足對(duì)機(jī)體都有不可忽視的影響[1]。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國(guó)有近66.7 %的人口不同程度缺硒[2]，因其有益與有害的閾值較低，故開發(fā)安全有效的硒資源非常有必要。茶是一種非常流行的飲品，茶樹的富硒能力較強(qiáng)，但是其硒含量因品種、部位和生長(zhǎng)環(huán)境的不同而表現(xiàn)出較大的差異[3]，茶樹硒累積的分子機(jī)理至今尚并不明確。bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與植物多種生物學(xué)過程，對(duì)茶樹bHLH基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，有助于理解其在茶樹硒吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的生物學(xué)功能，進(jìn)一步對(duì)利用生物技術(shù)手段調(diào)控茶葉硒含量以及茶樹新品種的培育都具有非常重要的作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】轉(zhuǎn)錄因子bHLH(basic helic-loop-helic，bHLH)廣泛存在于真核生物中[4]，是植物體內(nèi)第二大家族轉(zhuǎn)錄因子。bHLH結(jié)構(gòu)域約含60個(gè)氨基酸，由2個(gè)功能不同的區(qū)域組成，一個(gè)是能與DNA結(jié)合的堿性區(qū)域[5]，另一個(gè)是α螺旋-環(huán)-α螺旋結(jié)構(gòu)，其中的α螺旋親水又親脂，被不同長(zhǎng)度的連接區(qū)分開[6]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)部或者轉(zhuǎn)錄因子之間的2個(gè)α螺旋可以相互作用，形成同源或者異源二聚體，并與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合，對(duì)下游基因發(fā)揮調(diào)控作用[7]。目前，通過對(duì)一些重要物種的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、煙草(NicotianatabacumL.)、水稻(OryzasativaL.)、葡萄(VitisvinferaL.)、玉米(Zeamays)、楊樹(Populustrichocarpa)等中分別含有164、190、180、191、276、183個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子[8-10]。在植物中該類轉(zhuǎn)錄因子主要參與了與種子萌發(fā)[11-12]、雄性不育[13]、分枝發(fā)育[14]、離子轉(zhuǎn)運(yùn)[15]、激素應(yīng)答[16-17]、逆境脅迫[18-19]等過程。茶樹bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究也有一些進(jìn)展，如CsbHLH2從抗逆性較強(qiáng)的品種‘陜茶一號(hào)’中被成功克隆出來[20]，趙磊等[21]發(fā)現(xiàn)CsbHLH2和CsbHLH24與茶樹類黃酮合成相關(guān)，然而通過對(duì)bHLH的進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，在功能已知的第IIIf亞組中，沒有茶樹基因組中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，認(rèn)為更多的茶樹bHLH需要進(jìn)一步挖掘；孫彬妹等[22]克隆了2個(gè)與擬南芥高度同源bHLH轉(zhuǎn)錄因子GL3和EGL3，分析發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)控了花青素的合成。迄今為止，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在茶樹硒富集過程中的作用少有報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)茶樹品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過分析篩選出一個(gè)表達(dá)豐度較高、差異倍數(shù)較大的bHLH轉(zhuǎn)錄因子(Unigene0020663)，結(jié)合基因功能注釋，將其命名為CsbHLH62，通過對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討其生物學(xué)功能?！緮M解決的問題】旨在為進(jìn)一步驗(yàn)證該基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與測(cè)序分析

1年生茶苗(鄂茶1號(hào))于2016年夏季在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所溫室大棚進(jìn)行水培培養(yǎng)(處理?xiàng)l件為內(nèi)部資料，未發(fā)表)，分別對(duì)茶樹的根部及葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.2 生物信息學(xué)分析方法

CsbHLH62基因的開放閱讀框采用NCBI中的ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)，功能結(jié)構(gòu)利用ScanProsite程序(http://www.expasy.org/tools/scanprosite/)分析，編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)采用ProtParam程序(https://expasy.org/tools/protparam.html)分析，信號(hào)肽分析、跨膜結(jié)構(gòu)域與亞細(xì)胞定位分別由在線軟件SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)預(yù)測(cè)，磷酸位點(diǎn)預(yù)測(cè)利用在線軟件NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進(jìn)行，二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分別由在線程序SMOPA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測(cè)，采用軟件DNAman和MEGA6進(jìn)行多序列比對(duì)和同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsbHLH62基因的開放閱讀框分析

該基因全長(zhǎng)933 bp，共編碼277個(gè)氨基酸，開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)831 bp，5’非編碼區(qū)(5’UTR)長(zhǎng)102 bp。

2.2 CsbHLH62基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

利用在線程序ProtParam分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，得到該基因編碼蛋白的化學(xué)方程式為C1318H2122N390O438S9，預(yù)測(cè)分子量30728.24 kD，共包括4277個(gè)原子，理論等電點(diǎn)7.73，脂肪系數(shù)62.64，不穩(wěn)定系數(shù)36.46(不穩(wěn)定指數(shù)大于40時(shí)，表示不穩(wěn)定)，表明該蛋白穩(wěn)定。

該基因編碼276個(gè)氨基酸，組成中最多的氨基酸是絲氨酸(Ser)，所占比例為11.6 %，其次是亮氨酸(Leu)和賴氨酸(Lys)，均占7.6 %(圖1)。另外，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)是36，正電荷殘基總數(shù)(Arg + Lys)是37。

利用Protscale程序預(yù)測(cè)CsbHLH62編碼產(chǎn)物的疏水性/親水性(圖2)，分析氨基酸殘基的分值發(fā)現(xiàn)，多肽鏈的第191位具有最高的分值1.422，疏水性最強(qiáng)；第104和106位具有最低的分值-2.933，親水性最強(qiáng)，總平均親水性(Grand average of hydropathicity )為-0.851，整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，故推測(cè)該蛋白是一種可溶性蛋白這有利于其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能。

2.3 CsbHLH62編碼蛋白的信號(hào)肽分析、跨膜結(jié)構(gòu)域與亞細(xì)胞定位

利用軟件SignalP4.1進(jìn)行信號(hào)肽(Signal peptide)分析，結(jié)果如圖3所示。C-score是原始信號(hào)肽裂解位點(diǎn)的分值，數(shù)值越大表明該點(diǎn)出現(xiàn)裂解位點(diǎn)的概率就越大；S-score是信號(hào)肽分值，數(shù)值越大表明該氨基酸位于信號(hào)肽區(qū)域的可能性就越大，數(shù)值越低表示該氨基酸不含信號(hào)肽或者位于成熟蛋白部分；Y-score是基于C值和S值的斜率得出的幾何平均數(shù)，是最大可能的信號(hào)肽裂解位點(diǎn)；D-score是S均值和Y最大值的加權(quán)平均值，用于區(qū)分信號(hào)肽和非信號(hào)肽[23]。C、S、Y的最大值值分別是0.109、0.116、0.105，S-mean和D值分別是0.097、0.101，另外Signal peptide結(jié)果顯示為No，表明CsbHLH62編碼的蛋白不存在信號(hào)肽，是一種非分泌蛋白。

圖1 氨基酸含量分布Fig.1 Distribution of amino acid content

通過TMHMM分析CsbHLH62蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示，CsHLH62編碼的1～277位氨基酸都位于細(xì)胞膜表面，另外，蛋白N端位于膜內(nèi)的可能性為0.01881，非跨膜螺旋區(qū)預(yù)測(cè)值是0，該值大于18表示預(yù)測(cè)蛋白是跨膜蛋白[23]，綜合分析表明CsbHLH62基因編碼產(chǎn)物不是跨膜蛋白質(zhì)，在細(xì)胞中處于游離狀態(tài)。采用Cell-PLoc 2.0[24]程序進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明該基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞核。

圖2 CsbHLH62編碼蛋白疏水性/親水性分析Fig.2 Hydrophilia/hydrophobicity analysis of CsbHLH62 encoding protein

圖3 CsbHLH62編碼產(chǎn)物信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.3 Signal peptide prediction of CsbHLH62 encoding protein

2.4 CsbHLH62與其他植物間的多序列比對(duì)和進(jìn)化分析

利用NCBI上Blast在線工具，對(duì)CsbHLH62編碼蛋白進(jìn)行同源性檢索，發(fā)現(xiàn)其與胡桃(JuglansregiaXP_018844170.1)、綠豆(Vignaradiatavar.RadiataXP_014496615.1)、大豆(GlycinemaxXP_003532257.1)、桃(PrunuspersicaXP_007201182.1)、菜豆 (PhaseolusvulgarisXP_007140690.1)、短小蛇根草 (OphiorrhizapumilaBAU67840.1)、木豆(CajanuscajanXP_020234271.1)、歐洲越橘(VacciniumcorymbosumAOY34395.1)、棗(ZiziphusjujubaXP_015892293.1)的相似性在50 %～70 %，其中與歐洲越橘的序列同源性最高，相似性為68 %。通過對(duì)bHLH62編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性分析(圖5)，發(fā)現(xiàn)該基因在不同植物間結(jié)構(gòu)上保守性較強(qiáng)。

圖4 CsbHLH62編碼產(chǎn)物跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.4 Transmembrance domain prediction of CsbHLH62 encoding protein

圖5 bHLH62同源基因氨基酸序列對(duì)比Fig.5 Homologous alignments of the bHLH62 genes

采用MEGA6.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)，結(jié)果表明CsbHLH62基因與歐洲越橘bHLH024親緣關(guān)系最近，推測(cè)與其具有相似的功能。

2.5 CsbHLH62編碼產(chǎn)物的功能結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析

將CsbHLH62基因編碼序列輸入ScanProsite在線程序，進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域搜索，結(jié)果表明該基因編碼蛋白有1個(gè)Myc型的螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域分布在第131～181位氨基酸之間。

數(shù)字表示支持率，分枝長(zhǎng)短代表親緣關(guān)系遠(yuǎn)近圖6 不同物種的bHLH62編碼產(chǎn)物的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of bHLH62 genes in different plants

應(yīng)用NetPhos 3.1 Server在線軟件對(duì)CsbHLH62基因翻譯后磷酸化情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖所示，該基因編碼的蛋白可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)有35個(gè)，其中絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)可能發(fā)生磷酸化修飾的位點(diǎn)分別有24、10、1個(gè)(圖7～8)。

2.6 CsbHLH62編碼產(chǎn)物的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SMOPA程序預(yù)測(cè)CsbHLH62編碼產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖9所示，134個(gè)氨基酸形成了無規(guī)則卷曲(Random coil)，占整體的48.38 %；86個(gè)氨基酸組成α-螺旋(Alpha helia)結(jié)構(gòu)，占整個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的31.05 %；延伸鏈(Extended strand)和β轉(zhuǎn)角(Beta turn)分別由35、22個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，在所占比例分別為12.64 %和7.94 %。以上結(jié)果表明無規(guī)則卷曲和α-螺旋是CsbHLH62編碼產(chǎn)物的主要結(jié)構(gòu)。

圖7 CsbHLH62編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)域分析Fig.7 Domain analysis of CsbHLH62 encoding protein

圖8 CsbHLH62編碼產(chǎn)物磷酸位點(diǎn)分析Fig.8 Phosphorylation sites analysis of CsbHLH62 encoding protein

圖9 CsbHLH62編碼產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Secondary structure prediction of CsbHLH62 encoding protein

圖10 CsbHLH62編碼產(chǎn)物三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 3D structure of prediction of CsbHLH62 encoding protein

將 CsbHLH62氨基酸序列提交至Phyre2中進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到了該基因編碼產(chǎn)物的三維模型(圖10)。

3 討 論

茶樹是一種重要的經(jīng)濟(jì)型作物，培育優(yōu)良茶樹品種對(duì)于茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。前期通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)一個(gè)在根部表達(dá)豐度較高的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，該結(jié)果與黃芪響應(yīng)硒的研究相似[25]，但其在硒吸收及累積過程中的生物學(xué)功能還不明確，本研究通過對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為后續(xù)的研究做好準(zhǔn)備。

CsbHLH62基因編碼是一種可溶性蛋白，無信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成，這與在苦蕎、蘋果和丹參等物種中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的分析結(jié)果一致[26-28]，該基因定位在細(xì)胞核中，這與在茶樹中另一bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究類似[20]。其中二級(jí)結(jié)構(gòu)中的無規(guī)則卷曲所占比例最大，前人認(rèn)為其可用于分子識(shí)別，在蛋白質(zhì)特性和功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[29]；而對(duì)于該基因的三維結(jié)構(gòu)，雖然SWISS-MODEL同源建模應(yīng)用較廣，但可能會(huì)出現(xiàn)目標(biāo)基因預(yù)測(cè)模型和模板不一致的情況，而Phyre2使用遠(yuǎn)程同源檢測(cè)的方法，較好地彌補(bǔ)了這一缺陷[30]；此外，CsbHLH62因含有MYC型的bHLH結(jié)構(gòu)域而歸屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子家族。以往研究發(fā)現(xiàn)MYC類轉(zhuǎn)錄因子是植物茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的核心轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、次級(jí)代謝和抵御反應(yīng)中具有重要的作用[31]。比如擬南芥中的MYC2與JA誘導(dǎo)的許多抗蟲基因正相關(guān)，對(duì)提高其抵抗蟲害的能力中發(fā)揮重要作用[32]。在煙草中MYC類轉(zhuǎn)錄因子也參與了尼古丁的生物合成[33]。在本研究中，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)茶樹受到硒的刺激后，茉莉酸類相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化，根據(jù)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，猜測(cè)CsbHLH62是與茉莉酸類相關(guān)基因的DNA結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控其下游的響應(yīng)基因，該結(jié)論尚需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究利用生物信息學(xué)手段獲得關(guān)于CsbHLH62基因及其編碼產(chǎn)物的預(yù)測(cè)結(jié)果，為進(jìn)一步對(duì)該基因的克隆、時(shí)空表達(dá)特征以及亞細(xì)胞定位和功能驗(yàn)證等奠定前期基礎(chǔ)。