梁靜思，王偉偉，單 慧，楊 洋，李燦輝，唐 唯*

(1. 云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院，云南 昆明 650500；2.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500)

【研究意義】馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯第一大病害，由卵菌Phytophthorainfestans引起[1]。防治晚疫病的一個有效手段是選擇針對晚疫病菌有效的廣譜抗性基因(RB gene)品種，RB基因來源于野生型馬鈴薯品種S.bulbocastanum，對幾乎所有晚疫病菌都存在部分抗性[2-3]，因?yàn)橥硪卟【毡榇嬖赗XLR效應(yīng)物ipiO家族，二者符合基因?qū)蚧プ髂Ｊ絒4]。最新研究已經(jīng)明確，ipiO基因家族起主要作用的功能基因之一就是無毒基因Avr-blb1[5]。目前為止，對于P.infestans有性生殖發(fā)生所導(dǎo)致ipiO結(jié)構(gòu)和功能的變異，還未有相關(guān)的系統(tǒng)研究報道。【前人研究進(jìn)展】馬鈴薯晚疫病菌為異宗配合卵菌,中國于1996年報道發(fā)現(xiàn)A2交配型菌株。云南省情況類似，1998年前占統(tǒng)治地位的菌株為A1菌株，未見有發(fā)現(xiàn)A2菌株的報道。1999年云南省個別地區(qū)發(fā)現(xiàn)A2交配型菌株但出現(xiàn)的頻率極低[6]，2002-2005年對云南省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)觀察742份田間病樣，未發(fā)現(xiàn)卵孢子的存在，在所分離的菌株中也未發(fā)現(xiàn)A2或自育菌株[7]。2008年及以后采集的菌株測定結(jié)果表明，在整個云南省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)A2交配型菌株變成了優(yōu)勢群體，A1菌株數(shù)量呈明顯下降趨勢，并且，除了發(fā)現(xiàn)自育型菌株外，還檢測到了一定比率的A1A2菌株(該類型菌株和A1或A2接觸均能產(chǎn)生卵孢子但自身不能產(chǎn)生卵孢子)[8-9]。由于自育型菌株和A1A2型菌株相比A1或A2型菌株，更容易在田間產(chǎn)生卵孢子，因此，云南省馬鈴薯晚疫病菌交配型的這一變化，大大增加了田間發(fā)生有性生殖的可能性[10]。有研究報道發(fā)現(xiàn)，由卵孢子萌發(fā)產(chǎn)生的有性生殖F1代群體中Al和A2交配型分離比遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離1∶1, 其中A2交配型的菌株要少于A1，并不遵循孟德爾經(jīng)典的遺傳分離規(guī)律，而且在F1代中也發(fā)現(xiàn)了對甲霜靈抗性和生理小種的分離[11-13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】馬鈴薯晚疫病菌有性生殖的發(fā)生，可能導(dǎo)致菌株無毒基因序列和功能的變異，使得寄主內(nèi)R基因無法識別，導(dǎo)致馬鈴薯主栽品種面臨晚疫病抗性丟失的巨大風(fēng)險。因此，本研究將從以下幾方面開展：以云南省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)不同交配型晚疫病菌為材料，采用對峙培養(yǎng)法進(jìn)行卵孢子產(chǎn)孢能力的測定以及有性生殖F1代的誘導(dǎo)；對F1代菌株無毒基因Avr-blb1核苷酸序列進(jìn)行多態(tài)性分析；用云南省馬鈴薯主要栽培品種合作88對F1代群體進(jìn)行毒性測定。【擬解決的關(guān)鍵問題】明確馬鈴薯晚疫病菌有性生殖的發(fā)生所導(dǎo)致的無毒基因變異特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 晚疫病菌采集及交配型檢測

1.1.1 菌株采集和保存 2013年7月20日至8月5日，從云南省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)(昭通市、大理市、麗江市、昆明市、宣威縣、曲靖市、紅河州)采集病樣，經(jīng)純化和單孢分離后保存于PDA培養(yǎng)基上[9]。標(biāo)準(zhǔn)菌株A1(80029，DN111)以及A2(88133，IPO428-2)為本實(shí)驗(yàn)室前期保存。

1.1.2 菌株的交配型測定 交配型測定采用平板對峙培養(yǎng)法：若待測菌株與A2交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株對峙產(chǎn)生卵孢子，則待測菌株為A1交配型；反之，若與A1交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株對峙產(chǎn)生卵孢子，則為A2交配型；若待測菌株分別與A1和A2交配型菌株對峙培養(yǎng)都有卵孢子產(chǎn)生，但繼代繁殖和保存培養(yǎng)期間未發(fā)現(xiàn)卵孢子形成，則將其定義為A1A2交配型；若待測菌株在培養(yǎng)和繁殖過程中就能產(chǎn)生卵孢子，則定義為自育(Self-Fertile, SF)型；若待測菌株在上述處理中均不能產(chǎn)生卵孢子，則定義為A0型[6]。每個菌株交配型測定需同時用2套標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行，結(jié)果一致的情況下才可確定待測菌株的交配型。

1.2 卵孢子產(chǎn)生能力的測定

1.2.1 對峙培養(yǎng)親本菌株選擇 根據(jù)交配型測定結(jié)果，選取A1和A2交配型菌株隨機(jī)組合在18 ℃條件下進(jìn)行對峙培養(yǎng)14 d后，在菌絲融合區(qū)域刮取1 mm厚，5 mm直徑培養(yǎng)基，在20X光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計卵孢子個數(shù)，取3次觀察的數(shù)據(jù)，做單因素ANOVA分析，選取卵孢子產(chǎn)生較多的3對親本組合進(jìn)行卵孢子后代萌發(fā)條件及后代無毒基因多樣性研究。

1.2.2 卵孢子的萌發(fā) 對1.2.1測定結(jié)果中的3對親本進(jìn)行對峙培養(yǎng)及誘導(dǎo)卵孢子的萌發(fā)，萌發(fā)方法參照文獻(xiàn)[14-15]進(jìn)行，其中培養(yǎng)條件略有改動(19 ℃改為18 ℃)。卵孢子萌發(fā)后計算萌發(fā)率。

1.2.3 MTT染色 卵孢子的MTT染色方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行[16]。

1.3 F1代晚疫病菌無毒基因Avr-blb1序列多態(tài)性檢測

1.3.1 晚疫病菌基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增P．infestans基因組DNA提取方法參照[17]，Avr-blb1無毒基因檢測引物為Avr-blb1f(5-CGCATCGATGGTTTCATCCAATCTCAACACCGCCG-3)，Avr-blb1r(5- GATGCGGCCGCTATACGATGTCATAGCATGACA-3)[18], 目標(biāo)片段456 bp，包含完整ORF。擴(kuò)增體系為：5～20 ng的模板DNA，5 μl MgCl2(25 mM)，5 μl的10×Taqbuffer，2 μl dNTPs(2.5 mM)，各2 μl的正向和反向引物(10 μM)，0.4 μl的Taq酶(5 μ/μl)，加ddH2O至終體積50 μl，擴(kuò)增條件為: 95 ℃ 3 min，(95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30 cycles)，72 ℃ 5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μl用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 序列多態(tài)性研究 PCR產(chǎn)物雙向測序(華大基因)后拼接，獲得完整ORF，序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，序列比對在軟件VectorNTI 11.5 中進(jìn)行，用軟件DnaSP 6.11 進(jìn)行DNA多態(tài)性分析；用MEGA 5.0 最大似然法分析有性生殖F1代菌株Avr-blb1基因多樣性。

1.4 晚疫病菌有性生殖后代對馬鈴薯的毒性測定

1.4.1 無性孢子懸浮液制備 取于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7～14 d的有性F1代菌株，加入5 mL的滅菌蒸餾水(ddH2O)，用無菌毛筆從菌落表面掃脫無性孢子囊，收集洗脫液，將孢子洗脫液濃度稀釋為2×104spores/mL，放入4～6 ℃冰箱處理4 h，促進(jìn)游動孢子釋放后，及時進(jìn)行致病性的接種測定[19-20]。

表1 本研究所采菌株Table 1 Isolates used in this study

1.4.2 接種方法 以云南省馬鈴薯主栽品種合作88為寄主，以盆栽苗且大于3 cm直徑的葉片為對象，每個菌株接種3個葉片，在每個葉片背面主葉脈兩邊上各1滴10 μl孢子懸浮液為1個處理，18 ℃ 16 h光照/8 h黑暗條件下保濕培養(yǎng)，接種后第2 d把葉片翻轉(zhuǎn)，從接種后的第3天起每日觀察和記錄檢測結(jié)果，連續(xù)觀察和記錄4次。鏡檢觀察葉片表面孢子囊是否產(chǎn)生。產(chǎn)生孢子囊的記為感病，不產(chǎn)生孢子囊的記為抗病。在1個處理的3片葉子中，至少2片葉子均出現(xiàn)孢子囊的情況下，方能確定感病[21]。每個菌株共接種9片葉片，為3個處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的采集及交配型分析

本研究從4個地區(qū)的4個馬鈴薯主栽品種上采集和分離純化得到了共19個菌株，對這些菌株的交配型測定表明，A2交配型15株，占78.9 %，是優(yōu)勢群體，A1交配型僅有1株(5.2 %)，A1A2交配型 2株(10.4 %)，SF型1株(5.2 %，表1)。

2.2 對峙培養(yǎng)卵孢子產(chǎn)生能力對比

交配型檢測發(fā)現(xiàn)A1僅1株(DB1205), 因此該菌株為親本菌株之一，選取來自于不同寄主品種的A2交配型菌株JC1201，DB1202，ML1211以及HQ1202，分別和DB1205進(jìn)行對峙培養(yǎng)至第14 d，發(fā)現(xiàn)HQ1202組合卵孢子的產(chǎn)生數(shù)量和其它組合有顯著性差異(sig=0.012≤0.05，圖1)。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，采用JC1201, DB1202以及 ML1211分別和DB1205為3個組合，記為組合1、2和3。

2.3 有性生殖條件優(yōu)化及有性后代獲得

對3對組合配對得到的卵孢子進(jìn)行MTT染色發(fā)現(xiàn)，卵孢子的活力分別為57.56 %，49.31 %和34.08 %。對產(chǎn)生的卵孢子進(jìn)行萌發(fā)測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵孢子的平均萌發(fā)率達(dá)到6 %;隨機(jī)挑選得到DB1205 × JC1201(10株), DB1205 × DB1202(10株),以及DB1205 × ML1211(10株)有性F1代菌株，對共30株進(jìn)行交配型測定發(fā)現(xiàn)，交配型分離比分別為 1∶9，3∶7和0∶10 (A1∶A2)，其中A2占絕對優(yōu)勢，3個組合F1代的交配型分離比遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離1∶1，不符合孟德爾遺傳分離規(guī)律，且和前人研究的分離群體中A1交配型占優(yōu)勢的結(jié)果相悖[9,13](表2)。

圖1 4個對峙培養(yǎng)處理產(chǎn)生的卵孢子量對比Fig.1 The number of oospore producing in 4 paired culture treatments

表2 卵孢子產(chǎn)生及F1代交配型分離比Table 2 Oospore formation and segregation ratio of mating type

2.4 有性生殖F1代無毒基因Avr-blb1序列多態(tài)性

用引物 Avr-blb1f和Avr-blb1r擴(kuò)增30個F1代菌株，均得到特異性的1條大小為456 bp的單一條帶，部分菌株擴(kuò)增電泳如圖2所示。

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向序列測定和BLAST分析可以看出，30個F1代菌株和Genebank中KP308186.1的同源性達(dá)98 %或以上，序列間表現(xiàn)出的多樣性系數(shù)較低，DB1205 × JC1201和DB1205 × DB1202有性后代基因分離水平高于DB1205 × ML1211有性后代，多態(tài)性統(tǒng)計結(jié)果如表3所示。

對30個F1代菌株的遺傳進(jìn)化分析可以看出，組合1后代分為了單獨(dú)的一支，組合2和組合3的后代親緣關(guān)系較近沒有明確分開(圖3)；結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在使用同一親本(DB1205，A1)的情況下，使用不同的A2菌株進(jìn)行的有性生殖發(fā)生過程，也導(dǎo)致了群體多樣性水平較低，但依然有核苷酸水平的多態(tài)性分離，說明有性生殖的發(fā)生是菌株產(chǎn)生毒性變異的重要原因之一。

M: 500 bp DNA ladder，1～9：DB1205 × JC1201 有性F1代9個菌株，10：空白對照M: 500 bp DNA ladder，1-9：DB1205 × JC1201 9 isolates of F1 offsprings, 10: Control圖2 有性生殖F1代部分菌株擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of F1 offsprings by sexual reproduction

2.5 有性生殖F1代對寄主的毒性分離情況

為了驗(yàn)證馬鈴薯晚疫病菌發(fā)生有性生殖是否導(dǎo)致菌株的毒性變異，本研究采用對馬鈴薯晚疫病抗性較高的品種合作88進(jìn)行。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組合1、組合2的20個有性生殖F1代菌株毒性發(fā)生分離，組合3的10個有性生殖F1代菌株和親本相比毒性沒有明顯差異(表4)。

3 討 論

云南省是生產(chǎn)馬鈴薯的大省，晚疫病是云南省馬鈴薯主要病害之一，本研究采集的19株P(guān).infestans中，15株均為A2交配型，是病原菌的優(yōu)勢群體，這與前人研究一致[7-8]，A2交配型菌株的大量存在，預(yù)示著田間病原菌群體結(jié)構(gòu)發(fā)生著劇烈變化，多數(shù)研究認(rèn)為A2交配型菌株對馬鈴薯的毒性都強(qiáng)于A1交配型菌株，特別是A2交配型超級生理小種Blue-13菌株的出現(xiàn)[16]?？赡軐?dǎo)致目前主栽品種晚疫病抗性的喪失，最終導(dǎo)致晚疫病大面積的流行。本研究在田間采集病樣的過程中，對部分樣品進(jìn)行了鏡檢，并沒有發(fā)現(xiàn)卵孢子的存在。因此，有性生殖是否在田間普遍發(fā)生，目前還不明確。

卵孢子的萌發(fā)一直是P.infestans有性生殖研究的難點(diǎn)之一，前人研究了不同培養(yǎng)條件下的卵孢子萌發(fā)率，最高可達(dá)到11.8 %[13]。在本研究所用的誘導(dǎo)條件下，得到的卵孢子平均萌發(fā)率為6 %，低于相關(guān)文獻(xiàn)報道，可能的原因?yàn)榫曛g的差異，也可能是所用培養(yǎng)基的不同導(dǎo)致。MTT對卵孢子染色的表明3個親本組合產(chǎn)生的卵孢子活性差異較大，分別為57.56 %,49.31 %和34.08 %。由于不同組合的誘導(dǎo)方法完全相同，親本之一也是同一個菌株(DB1205)，因此，卵孢子活性不同的主要原因應(yīng)該是A2交配型親本差異造成的。所以，采用本研究誘導(dǎo)方法可穩(wěn)定誘導(dǎo)得到P.infestans的卵孢子萌發(fā)后代，為后續(xù)深入研究有性生殖發(fā)生機(jī)制提供技術(shù)支持。

表3 有性生殖F1代序列多態(tài)性分析Table 3 Sequence diversity of F1 offsprings by sexual reproduction

圖3 30個有性生殖F1代群體及其親本的最大似然法分析Fig.3 Maximum-likelihood analysis of 30 F1 offsprings by sexual reproduction

研究報道稱交配型可能是由1個特定的位點(diǎn)控制，A1為雜合子(Aa),A2為純合子(aa)，因此，分離后代中形成純合子的幾率要大于形成雜合子的幾率，但該推論目前沒有實(shí)驗(yàn)證據(jù)[11]。本研究測得P.infestans有性生殖F1代的交配型分離比嚴(yán)重偏離孟德爾遺傳分離規(guī)律，但后代群體數(shù)量較小并不能完全反映出真實(shí)的分離情況，因此要建立一個晚疫病菌交配型模型是比較困難的，除了需要大量的后代分離群體外，還需要一定數(shù)量的親本組合。

ipiO基因?qū)︸R鈴薯的毒性密切相關(guān)。研究表明，ipiO基因家族的2個同源基因ipiO1和ipiO2，在基因組中為單拷貝，且基因中不包含內(nèi)含子[22]。因此，在有性生殖發(fā)生的情況下，2個親本所包含的單拷貝ipiO1和ipiO2會發(fā)生交換和重組，導(dǎo)致核苷酸和氨基酸水平多態(tài)性的發(fā)生，進(jìn)而影響到ipiO基因的變異。有證據(jù)表明，在晚疫病菌侵染寄主植物的初期，可以檢測到ipiO基因的高水平表達(dá)，但隨著侵染過程的持續(xù)發(fā)生，其表達(dá)量逐漸下降至正常水平[23]，所以，檢測的功能及變異應(yīng)該在侵染初期進(jìn)行。和ipiO基因一樣，晚疫病菌中的多數(shù)無毒基因和效應(yīng)物在有性生殖發(fā)生的條件下均可能發(fā)生變異。本研究中，在同1個親本(A1)的條件下，有性生殖F1代群體中Avr-blb1序列發(fā)生了多態(tài)性分離，盡管目前尚不明確馬鈴薯品種合作88中所含抗性、基因及效應(yīng)物的類型及數(shù)量，但接種測定發(fā)現(xiàn)，3對親本組合在合作88上，全部為抗性，在F1代群體中出現(xiàn)了23.3 %的敏感型表現(xiàn)的菌株，這一結(jié)果說明了在有性生殖的后代中，和致病性相關(guān)的基因發(fā)生了變異。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可進(jìn)一步擴(kuò)大有性生殖F1代群體數(shù)量，更為準(zhǔn)確的解析交配型基因的遺傳分離規(guī)律；利用已公布的P.infestans基因組注釋數(shù)據(jù)及EST數(shù)據(jù)，高通量的尋找和致病性相關(guān)的分子標(biāo)記，明確交配型相關(guān)基因的定位；構(gòu)建含有不同R基因的馬鈴薯株系，更深入的了解馬鈴薯——P.infestans的互作機(jī)制。

表4 有性生殖F1代毒性檢測結(jié)果Table 4 Pathogenicity test of F1 offsprings by sexual reproduction

4 結(jié) 論

本研究采集并分離純化19株馬鈴薯晚疫病菌，共發(fā)現(xiàn)3種交配型；構(gòu)建了穩(wěn)定的卵孢子萌發(fā)體系，卵孢子萌發(fā)率達(dá)6 %；得到有性生殖F1代菌株30株，在有性后代中，發(fā)現(xiàn)了無毒基因Avr-blb1序列的多態(tài)性及對馬鈴薯合作88的毒性分離現(xiàn)象。

致謝：感謝云南省會澤縣農(nóng)科所、大理州農(nóng)科院在采樣過程中提供的幫助；在實(shí)驗(yàn)實(shí)施過程中，感謝云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院王洪洋講師、段曉艷講師及郝大海實(shí)驗(yàn)師在序列分析、菌株毒性測定以及論文修改方面提供了技術(shù)支持。