王顏

摘要：葉綠體是植物細胞的重要細胞器，是植物光合作用的場所。每個葉綠體蛋白質(zhì)按照其功能分布在葉綠體的不同區(qū)域。根據(jù)結(jié)構(gòu)組成和生化特性將葉綠體分成3個部分，葉綠體被膜、葉綠體基質(zhì)和類囊體。植物蛋白的亞細胞定位是功能基因組學的重要內(nèi)容。近幾年來，常用的葉綠體蛋白質(zhì)亞細胞定位方法是以GFP及其突變體為報告基因的融合報告基因定位法。綜述了基于綠色熒光蛋白瞬時表達的融合蛋白構(gòu)建方法以及植物材料選擇，同時進行比較和分析，并改進不足之處。

關(guān)鍵詞：葉綠體蛋白質(zhì)；融合蛋白構(gòu)建

葉綠體是植物所特有細胞器，是光合作用的重要場所。據(jù)估計在高等植物中大約有21000-25000個蛋白，葉綠體蛋白占蛋白總數(shù)的10%-25%[1]，充分說明了葉綠體對植物的重要性。由于葉綠體是半自主性細胞器，其葉綠體蛋白大部分都是由核基因編碼，小部分由葉綠體基因編碼[2-3]。葉綠體蛋白主要分為以下幾種，葉綠體膜蛋白、葉綠體基質(zhì)蛋白、類囊體膜蛋白和類囊體腔蛋白。根據(jù)生化特性以及結(jié)構(gòu)組成將葉綠體分為以下3個部分：由內(nèi)被膜和外被膜構(gòu)成的葉綠體被膜、葉綠體基質(zhì)、類囊體膜和類囊體腔組成的類囊體[4]。

本研究對近幾年常用的葉綠體蛋白質(zhì)亞細胞定位融合蛋白構(gòu)建方法以及植物宿主載體選擇歸納總結(jié)、提出優(yōu)缺點并對不足之處進行改進，為得到更高效的葉綠體蛋白質(zhì)亞細胞定位方法提供信息。

1.融合蛋白構(gòu)建方法

1.1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。其轉(zhuǎn)化原理是將攜帶外源基因的DNA插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌感染組織細胞，使外源基因整合到植物的基因組中，再利用細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)得到轉(zhuǎn)基因植株[5]。從當前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀來看，葉綠體蛋白質(zhì)定位的植物瞬時表達系統(tǒng)中，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的浸花法和葉片注射法應(yīng)用較為廣泛。

1.1.1浸花法

浸花法是近幾年發(fā)展起來的一種快速、高效、穩(wěn)定的非組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因方法，是由Clough和Bent在真空滲透法的基礎(chǔ)之上演變而來[6]。真空滲透法是將農(nóng)桿菌菌液與植株放置在真空條件下進行侵染，而浸花法不需要進行真空處理，只需將農(nóng)桿菌菌液與植株直接接觸即可。

1.1.2注射法

收集農(nóng)桿菌菌液于2mL離心管，4000r/min離心5min，去上清，加0.8mL重懸液（MES 2.132g/L，MgCL2？6H2O 2.033g/L，pH=5.6，使用前加入200μmol/L乙酰丁香酮，50mL LB液體培養(yǎng)基加100μL乙酰丁香酮）重新懸浮；菌液濃度OD600值調(diào)整到0.8，放置1-3h；用無菌注射器將菌液注射到煙草葉片的下表皮，噴適量水，套保鮮袋，放置在22℃的溫室中，用19h的光照和6h的黑暗交替培養(yǎng)；次日揭保鮮袋，培養(yǎng)3-7d，用激光共聚焦顯微鏡觀察[10]。

1.2 PEG轉(zhuǎn)化法

PEG（聚乙二醇）是1種高分子化合物，在20%-25%的濃度下去壁的受體細胞原生質(zhì)體迅速縮水，細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆破壞前去掉PEG，細胞膜結(jié)構(gòu)就會又回復(fù)到穩(wěn)定狀態(tài)。

在此過程中，由于PEG可以與Ca2+等陽離子連接，Ca2+能在PEG和帶負電荷的質(zhì)粒DNA之間形成橋，從而促進外源基因進入到原生質(zhì)體內(nèi)[12]。該方法的詳細過程是，用解剖刀將幼嫩的葉片切成約0.5mm2大小的絲狀，放入10ml的酶解液中處理，酶解液為CPW鹽溶液加入了纖維素酶R10、離析酶MR10、甘露醇和MES，pH調(diào)制5.8，真空處理30min，在26℃氣浴恒溫振蕩器內(nèi)40r/min避光震蕩；用過濾網(wǎng)洗去未完全消化的沉淀物，700r/min離心5min；采用 PEG法轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，100μL原生質(zhì)體溶液和10μg質(zhì)粒，然后加入110μL 50%PEG溶液（9.1%甘露醇、10% CaCl2、40%PEG4000）慢慢混勻靜置30min，用W5溶液將混合物再次清洗3次，清洗后將混合物放置在25℃條件下暗培養(yǎng)16h，使用激光共聚焦顯微鏡觀察觀察基因表達情況.

2.結(jié)論與展望

由于葉綠體自帶紅色熒光，在亞細胞定位時要選擇與紅色反差較大的綠色或黃色熒光蛋白基因構(gòu)建表達載體。煙草和擬南芥都是表達外源植物基因常用的遺傳轉(zhuǎn)化材料，苗齡6-8周的煙草葉片和苗齡3-4周的擬南芥葉片，葉綠體含量多，細胞活性強，容易觀察。葉綠體蛋白質(zhì)亞細定位與功能發(fā)揮緊密聯(lián)系，細胞功能的發(fā)揮需要不同分區(qū)蛋白質(zhì)之間的相互作用、修飾以及動態(tài)變化等調(diào)控活動來體現(xiàn)。因而，從靜態(tài)定位研究發(fā)展到動態(tài)定位研究，成為蛋白質(zhì)亞細胞定位研究的新挑戰(zhàn)。隨著轉(zhuǎn)化方法的改進、研究技術(shù)的提高以及數(shù)據(jù)庫的不斷完善，葉綠體蛋白質(zhì)定位和功能的研究會更加清晰。為進一步對葉綠體在植物生長發(fā)育，遺傳代謝的相關(guān)研究打下了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Ouyang M， Li X， Ma J， et al. LTD is a protein required for sorting light-harvesting chlorophyll-binding proteins to the chloroplast SRP pathway[J]. Nature Communications， 2011， 2（1）：277.

[2]齊欣， 崔繼哲， 朱宏. 葉綠體的蛋白質(zhì)組學研究進展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展， 2007， 7（3）：440-442.

[3]Wijk K J V. Proteomics of the chloroplast： experimentation and prediction[J]. Trends in Plant Science， 2000， 5（10）：420-425.

[4]王金輝， 李軼女， 劉惠芬，等. 葉綠體蛋白質(zhì)組學研究進展[J]. 生物技術(shù)通報， 2011（2）：1-6.

[5]邢浩然， 劉麗娟， 劉國振. 植物蛋白質(zhì)的亞細胞定位研究進展[J]. 華北農(nóng)學報， 2006， 21（s2）：000001-6.

[6]徐芳， 熊愛生， 彭日荷，等. 植物遺傳轉(zhuǎn)化的新方法：Floral DiP[J]. 中國蔬菜， 2005， 1（3）：29-31.

[7]韋獻雅， 付紹紅， 牛應(yīng)澤. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)floral-dip轉(zhuǎn)基因方法研究進展[J]. 中國油料作物學報， 2006， 28（3）：362-367.

[8]黨智笙， 肖成斌， 馬燕林，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法（Floral-dip）存在的問題及對策[J]. 中國食品工業(yè)， 2014（6）：58-58.

[9]Clough S J， Bent A F. Floral dip： a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology， 1998， 16（6）：735–743.

[10]高建強， 梁華， 趙軍. 植物遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌浸花法研究進展[J]. 中國農(nóng)學通報， 2010， 26（16）：22-25.