肖倩， 王展強， 吳行貴， 張偉錚， 石文， 張軒， 羅燕芬， 陳茶

（1.廣東省中醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）作為一種常見的醫(yī)院獲得性感染的革蘭氏陰性條件致病菌，常引起呼吸道、消化道感染，危害人類的健康[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)PA生物被膜（biofilm）形成時，抗藥性增強甚至耐藥[3-5]。目前在臨床上治療PA感染仍具有挑戰(zhàn)性，一方面是因為多重耐藥菌株日益增多，抗生素治療陷入困境，另一方面是因為抗生素的不合理使用，使PA感染患者病情遷延難治。隨著“抗生素后時代”的到來，人們開始更多地求助于非抗生素治療。黃芪（補益類中藥）、穿心蓮（清熱解毒類中藥）是臨床方劑配伍中常用的2味中藥，均具有抑菌殺菌、增強機體免疫作用[6，7]。有研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽LL-37是在人體內(nèi)唯一發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性抗菌肽，具有廣譜的抗微生物活性和中和脂多糖的活性[8-12]。因此，本研究以銅綠假單胞菌為研究對象，以抗菌肽LL-37[13]為陽性對照，觀察中藥黃芪、穿心蓮單獨使用或與抗菌肽LL-37聯(lián)合應(yīng)用對銅綠假單胞菌生物膜的作用，評價黃芪、穿心蓮抗銅綠假單胞菌性能，探討其與抗菌肽LL-37是否有協(xié)同作用，為新藥物開發(fā)應(yīng)用提供新策略?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗菌株銅綠假單胞菌野生菌株P(guān)AO1為重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院鄒琳教授惠贈。

1.2主要試劑與儀器黃芪（批號：170800541）、穿心蓮（批號：16110864）均購自康美藥業(yè)股份有限公司；抗菌肽LL-37（批號：JT69395）購自南京杰肽生物科技有限公司。Multiskan FC酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3不同濃度中藥的配制分別用去離子水浸泡黃芪、穿心蓮1 h（每100 g中藥加500 mL去離子水）。用中藥煲煎制1 h，冷卻后用無菌濾膜過濾，除去細菌。用LB培養(yǎng)基將中藥原液稀釋2、4、8倍，分別配成高、中、低3種質(zhì)量濃度（100、50、25g/L），置4℃保存，備用。

1.4野生菌株P(guān)AO1生物膜培養(yǎng)取-80℃保存的PAO1于血平板上復(fù)蘇，37℃培養(yǎng)24 h，進行菌落形態(tài)觀察、革蘭染色、初步生化反應(yīng)。挑取血平板上各單個菌落，在LB培養(yǎng)基中進行增菌，調(diào)至0.5麥氏濃度，備用。取出配好的菌液恢復(fù)至室溫，用LB培養(yǎng)基稀釋菌液100倍，置于37℃恒溫搖床中平衡1 h。將長寬約0.5 mm無菌硅膠片置于24孔板中，將平衡后的菌液以1 000 μL/孔加入24孔板中，復(fù)孔6個，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d[14]，隔天換液，用于后續(xù)實驗。

1.5紫外分光光度法鑒定PAO1生物膜參考Jabalameli F等的方法[15]，取出培養(yǎng)PAO17 d的24孔板，棄去LB培養(yǎng)基。用滅菌注射用水清洗硅膠片2次以除去浮游菌，拍干后置于新的24孔板中，同時用無菌硅膠片作為陰性對照。在24孔板中以500 μL/孔加入結(jié)晶紫以固定生物膜并染色，3 min后棄去結(jié)晶紫，用滅菌注射用水清洗硅膠片3次，置于新的24孔板中，自然風干。向24孔板中以200 μL/孔加入300 g/L醋酸，置于搖床上15 min?；靹蚝螅靠孜?00 μL溶液于96孔板。應(yīng)用酶標儀測量吸光度[D（630 nm）]，記錄實驗結(jié)果。

1.6最小抑菌濃度（MIC）測定采用微量肉湯稀釋法檢測黃芪、穿心蓮和抗菌肽LL-37對銅綠假單胞菌PAO1的MIC。取出配好的菌液恢復(fù)至室溫，每孔加入濃度為2×106CFU/mL的對數(shù)生長期菌液100 μL。調(diào)整黃芪、穿心蓮各質(zhì)量濃度分為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0 g/L；調(diào)整抗菌肽LL-37質(zhì)量濃度分為1 024、512、256、128、64、32、16、0 μg/mL；無菌生理鹽水孔為陰性對照組，加菌液不加藥孔為空白對照組。以1∶1的比例加入96孔板中，每個濃度復(fù)孔3個，混勻置于CO2培養(yǎng)箱中過夜觀察結(jié)果，有細菌生長孔混濁，無細菌生長孔清亮且對應(yīng)的最小用藥濃度即為MIC值。

1.7黃芪、穿心蓮和抗菌肽LL-37單獨或聯(lián)合用藥對PAO1生物膜形成的影響實驗分組：黃芪、穿心蓮單獨用藥組（劑量均分別為100、50、25 g/L）；抗菌肽LL-37單獨用藥組（劑量分別為128、64、32、16 μg/mL）；聯(lián)合用藥組（64、32 μg/mL抗菌肽LL-37+100、50、25 g/L黃芪或穿心蓮）。另設(shè)無菌生理鹽水孔為陰性對照組，未加藥PA生物膜孔為空白對照組。將無菌硅膠片置于24孔板中，取出配好的菌液和各組藥物以1∶1的比例加入24孔板中，設(shè)3個復(fù)孔。按“1.4”項制備生物膜。應(yīng)用酶標儀測定吸光度D（630 nm）值。聯(lián)合用藥時計算抑菌濃度指數(shù)（FIC）[16]（FIC=D聯(lián)合后/D聯(lián)合前，當FIC≤0.5時，表示二者有協(xié)同作用）。

1.8黃芪、穿心蓮和抗菌肽LL-37單獨或聯(lián)合用藥對成熟生物膜的清除率用“1.4”項的方法培養(yǎng)生物膜若干，第7天時取出生物膜，置于新的24孔板中。PAO1野生菌株分別培養(yǎng)于隨機選擇的3塊硅膠片。采用紫外分光光度法測定各孔D（630 nm），檢驗生物膜的形成能力，再將各濃度藥物以每孔1 000 μL加入24孔板中，設(shè)3個復(fù)孔，24 h后再檢驗生物膜的形成能力。按以下公式計算生物膜清除率（p）：p=[藥物處理后D（λ）-藥物處理前D（λ）]/藥物處理前D（λ）×100%。聯(lián)合用藥時計算FIC。

1.9統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1紫外分光光度法檢測銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成情況圖1結(jié)果顯示：PAO1組D（630 nm）高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示野生菌株P(guān)AO1形成生物膜。

2.2黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37最低抑菌濃度表1結(jié)果顯示，各實驗濃度中藥黃芪、穿心蓮對PAO1無抑制作用，抗菌肽LL-37對PA的MIC為256 μg/mL。

2.3單獨用藥、聯(lián)合用藥對PA生物膜形成的影響

2.3.1 黃芪、穿心蓮及抗菌肽LL-37單獨用藥對PAO1生物膜形成的影響 圖2結(jié)果顯示：與空白對照組比較，不同濃度的黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨用藥組D（630 nm）值顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且穿心蓮組、抗菌肽LL-37組降低作用更明顯；各藥物不同濃度組間D（630 nm）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示不同濃度黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨用藥對野生菌株P(guān)AO1生物膜形成均具有抑制作用。

表1 黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37最低抑菌濃度的測定結(jié)果Table 1 The minimum inhibitory concentration of Radix Astragali，Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37

圖1 紫外分光光度法測PAO1生物膜形成情況Figure 1 UV spectrophotometric determination results of PAO1 biofilm formation

2.3.2 黃芪與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥對PAO1生物膜形成的影響 圖3結(jié)果顯示，25、50、100 g/L的黃芪分別與32、64 μg/mL的抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥不能抑制生物膜的形成。

2.3.3 穿心蓮與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥對PAO1生物膜形成的影響 圖4結(jié)果顯示：與空白對照組比較，100 g/L穿心蓮+64 μg/mL抗菌肽LL-37、100 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37、50 g/L穿心蓮+32 μg/mL 抗菌肽LL-37、25 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥組D（630 nm）值顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示穿心蓮與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥可抑制生物膜的形成，但FIC＞0.5，又提示聯(lián)合用藥并未產(chǎn)生協(xié)同作用。

2.4單獨用藥、聯(lián)合用藥對PAO1成熟生物膜的清除率

2.4.1 黃芪、穿心蓮和抗菌肽LL-37單獨用藥對PAO1成熟生物膜的清除率 表2結(jié)果顯示：單用黃芪（100、50、25 g/L）對PAO1成熟生物膜的清除率分別為-47.88%、-40.21%、-43.92%，清除近一半成熟生物膜；各濃度黃芪組清除率比較，差異不明顯。穿心蓮（100、50、25 g/L），抗菌肽LL-37（128、64、32、16 μg/mL）對PAO1成熟生物膜的清除率在29%～60%之間，均大于29%；隨著穿心蓮濃度的增加，PAO1成熟生物膜清除率逐漸減弱，而隨著抗菌肽LL-37濃度的增加，PAO1成熟生物膜清除率逐漸增強。

圖2 黃芪、穿心蓮及抗菌肽LL-37單獨用藥對PAO1生物膜形成的影響Figure 2 Effect of Radix Astragali，Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37 alone on PAO1 biofilm formation

圖3 黃芪與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥對PAO1生物膜形成的影響Figure 3 Effects of the combination of Radix Astragaliand antibacterial peptide LL-37 on PAO1 biofilm formation

圖4 穿心蓮與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥對PAO1生物膜形成的影響Figure 4 Effects of the combination of Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37 on PAO1 biofilm formation

表2 黃芪、穿心蓮及抗菌肽LL-37單獨用藥對PAO1成熟生物膜的清除率比較Table 2 Comparison of the clearance rate of PAO1 mature biofilm by Radix Astragali，Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37 alone

2.4.2 黃芪/穿心蓮與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥對PAO1成熟生物膜的清除率 表3結(jié)果顯示，25 g/L黃芪+32 μg/mL抗菌肽LL-37組和25 g/L黃芪+16 μg/mL抗菌肽LL-37組對PAO1成熟生物膜的清除率均大于25%，其他聯(lián)合組對PAO1成熟生物膜的清除作用不理想。FIC＞0.5，提示聯(lián)合用藥抗PAO1成熟生物膜形成亦不產(chǎn)生協(xié)同作用。

3 討論

PA的群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing system，QS系統(tǒng)）在細菌致病性和耐藥性方面發(fā)揮重要作用，具有調(diào)控細菌粘附、毒力因子分泌、生物膜形成等功能[17，18]。生物膜是由細菌產(chǎn)生的基質(zhì)封閉并粘附于彼此表面或分界面的細菌群落。生物膜形成后，環(huán)境適應(yīng)能力更強，一方面增加對附著面的粘附性，逃避宿主的免疫作用，另一方面阻止藥物進入到細菌內(nèi)部，使細菌耐藥性顯著增強。有研究指出，PA的慢性感染主要與生物膜這一生長模式、低毒性和生長速度慢有關(guān)，某些情況下生物膜對PA的毒力效應(yīng)具有更強的協(xié)同作用[19，20]。因此，破壞菌膜的多細胞結(jié)構(gòu)是清除菌膜的主要治療思路，干擾細胞信號系統(tǒng)也是一個很有前景的途徑。

表3 黃芪/穿心蓮與抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥對PAO1成熟生物膜的清除率Table 3 Comparison of the clearance rate of PAO1 biofilms by the combination of Radix Astragali/Herba Andrographis together with antibacterial peptide LL-37

近年來，中藥已成為研究抑菌藥物的來源之一[21]，其優(yōu)勢在于中藥某些成分具有天然抗菌抑菌活性。有文獻報道，中藥黃芪[22]、穿心蓮[23，24]從多個方面對PA的毒力因子、生物膜形成產(chǎn)生廣泛抑制作用。因此，在目前PA抗生素耐藥正處于嚴峻的形勢下，進一步深入研究PA的致病機制以及尋找針對PA感染的非抗生素治療具有重要的科學(xué)意義和臨床價值。

本研究首先成功構(gòu)建了穩(wěn)定生物膜模型，應(yīng)用紫外分光光度法測定生物膜形成能力，結(jié)果顯示PAO1組D（λ）和陰性對照組D（λ）分別為（0.126 3±0.015 2）和（0.036 0±0.001 5），按照Jabalameli F[15]的判斷標準，PAO1能形成生物膜且形成生物膜的能力為中等[2×空白對照組D（λ）＜實驗組D（λ）≤4×空白對照組D（λ）]，表明其形成的生物膜比較穩(wěn)定。

再者，黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨用藥對PAO1野生菌株生物膜的形成均具有抑制作用。穿心蓮和抗菌肽LL-37的抑制作用更明顯。各藥物不同濃度組間D（630 nm）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但D（630 nm）隨著濃度增加呈現(xiàn)減低趨勢，表明隨著PAO1生物膜的形成減少，藥物抑制生物膜形成能力增強，提示黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨用藥可抑制PAO1生物被膜的起始，在生物膜形成的第一步就發(fā)揮了重要的干預(yù)作用，呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)，與文獻[21]報道相符。該文獻[21]也報道高濃度黃芪提取液對吸光度造成干擾，同時低濃度（＜50g/L）黃芪對吸光度不造成干擾，顯示這種干擾程度在一定范圍內(nèi)較為恒定。本研究選取的黃芪濃度亦在此恒定范圍內(nèi)。

本研究觀察聯(lián)合用藥抑制生物膜形成的結(jié)果顯示：選取25、50、100 g/L的黃芪分別與32、64 μg/mL的抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥不能抑制生物膜的形成；100 g/L穿心蓮+64 μg/mL抗菌肽LL-37、100 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37、50 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37、25 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37聯(lián)合用藥均能抑制生物膜的形成，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明在生物膜形成早期，聯(lián)合應(yīng)用一定濃度的穿心蓮+抗菌肽LL-37具有明顯的抑制作用；但是聯(lián)合用藥尚未產(chǎn)生協(xié)同作用（FIC＞0.5），提示二者配伍使用不能達到較好的抑菌作用。

本研究觀察黃芪、穿心蓮、抑菌肽LL-37單獨用藥對已經(jīng)形成的成熟PAO1生物膜的清除作用，用清除率表示。黃芪（100、50、25 g/L）對PAO1成熟生物膜的清除率分別為-47.88%、-40.21%和-43.92%，清除近一半成熟生物膜。穿心蓮（100、50、25 g/L）、抗菌肽LL-37（128、64、32、16 μg/mL）對PAO1成熟生物膜的清除率均在29%～60%之間，均大于29%。黃芪各濃度的清除作用差異不明顯。穿心蓮隨濃度增加，對PAO1成熟生物膜的清除作用反而減弱。抗菌肽LL-37隨濃度增加，對PAO1成熟生物膜的清除作用越明顯，具有濃度依賴性，顯示出抗菌肽LL-37預(yù)防和治療難治性生物膜感染的巨大潛力。

本研究觀察聯(lián)合用藥對成熟生物膜抑制作用，研究結(jié)果顯示，25 g/L黃芪+32 μg/mL抗菌肽LL-37、25 g/L黃芪 +16 μg/mL 抗菌肽LL-37對PAO1成熟生物膜的清除率均大于25%。其他聯(lián)合組對PAO1成熟生物膜的清除作用不理想，對此現(xiàn)象有待進一步探討。聯(lián)合用藥抗PAO1成熟生物膜形成也不產(chǎn)生協(xié)同作用（FIC＞0.5）

綜上所述，黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨用藥均能夠早期抑制PAO1生物膜的形成，呈現(xiàn)濃度依賴性，并且在一定程度上清除成熟的生物膜。黃芪/穿心蓮與抗菌肽LL-37聯(lián)合應(yīng)用時，不具有協(xié)同作用。下一步擬在動物實驗中以驗證其效。