吳芳， 李克明， 隆毅， 王桂芝

（1.東營市第二人民醫(yī)院，山東東營，257335；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟南，250014；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山東濟南，250001；4.德州市中醫(yī)院，山東德州，253013）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是常見的微血管并發(fā)癥，其具有發(fā)病率高、致殘率高、危害性大、難以治愈等特點。流行病學(xué)研究顯示，我國糖尿病患者已高達9 240萬人[1]，且趨向年輕化，DN也出現(xiàn)相同的趨勢[2]，由DN造成的終末期腎病比例為15%[3]。近年來，丹參制劑在治療DN方面取得了一定的進展[4-6]，本院自制劑丹參降糖方在治療DN中也取得了良好的臨床療效。其中丹參發(fā)揮著重要作用?；诖?，為進一步探討丹參單味藥所起到的可能作用機制，為后續(xù)深入復(fù)方藥理研究提供堅實的理論基礎(chǔ)，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對其進行分析。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Network Pharmacology）利用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)與可視化技術(shù)，結(jié)合中藥治療疾病具有多靶點、多途徑與多靶點協(xié)同作用的特點，可為中醫(yī)藥機制研究提供新思路與途徑[7]。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1丹參入血活性成分篩選應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[8]檢索出丹參成分的數(shù)據(jù)，通過成分藥物動力學(xué)[9]參數(shù)進行篩選[10-12]。篩選的條件[13]為藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18；參考前期研究結(jié)果與文獻信息適當增補刪減。

1.2丹參調(diào)控靶點預(yù)測與“活性成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用TCMSP作用靶點預(yù)測模型演算上述入血活性成分的作用靶點，通過網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape 3.2.1構(gòu)建“活性成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)，分析其網(wǎng)絡(luò)特征[14]，其中“節(jié)點”（node）表示分子與靶蛋白，“邊”（edge）表示丹參成分與靶點之間的關(guān)系。

1.3已知的DN相關(guān)疾病靶點檢索檢索TTD[15]（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp） 、 DrugBank[16]（https：//www.drugbank.ca/） 、OMIM[17]（http：//www.omim.org/）、GAD[18]（https：//geneticassociationdb.nih.gov/）、PharmGKB[19]（https：//www.pharmgkb.org/）等與疾病靶點相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，以“diabetic nephropathy”為關(guān)鍵詞對DN疾病相關(guān)靶點進行檢索。

1.4蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點篩選藥物調(diào)控機體的病理生理過程往往存在極為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，除直接作用靶點外，更廣泛地存在間接調(diào)控的方式；通過蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系（protein-protein interaction，PPI）數(shù)據(jù)的構(gòu)建與挖掘為研究其復(fù)雜關(guān)系提供了途徑。利用插件“BisoGenet”對上述入血活性成分和疾病靶點分別進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和映射。

通過前期研究與網(wǎng)絡(luò)拓撲分析插件“CytoNCA”[20]得到上述網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中的自由度中心性（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）和局部邊連通性（local average connectivity，LAC）等指標。篩選標準：①DC值大于所有節(jié)點DC值中位數(shù)2倍的重要節(jié)點；②其他幾個指標大于所有節(jié)點中位數(shù)的節(jié)點，即得到關(guān)鍵基因。

1.5Pathway富集分析ClueGO是整合了基因本體論信息資源數(shù)據(jù)庫（GO）與京都基因和基因組百科全書（KEGG）相關(guān)數(shù)據(jù)。本研究采用“ClueGO”[21]對以上獲得的關(guān)鍵靶點進行信號通路富集分析以研究丹參治療DN可能的靶點與關(guān)鍵通路。其中，不同顏色的節(jié)點代表不同類型的信號通路，而其大小與信號通路呈正相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1丹參活性成分篩選與吸收、分布、代謝和排泄（ADME）性質(zhì)分析本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索到丹參所有成分202個，根據(jù)OB和DL等ADME參數(shù)篩選到入血活性成分65個，見圖1。

圖1 根據(jù)ADME參數(shù)篩選出的丹參入血活性成分分布Figure 1 Distribution of the blood active ingredients in Radix Salviae Miltiorrhizae screened with ADME parameters

2.2丹參作用靶點預(yù)測及“活性成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析利用TCMSP靶點預(yù)測模型預(yù)測技術(shù)對上述活性成分進行作用靶點預(yù)測，排除重復(fù)靶點，共獲得預(yù)測靶點103個，相互對應(yīng)關(guān)系1 349條；其中4個活性成分無對應(yīng)靶點，予以排除。利用Cytoscape構(gòu)建上述入血活性成分及預(yù)測的作用靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。

2.3DN相關(guān)靶點檢索分析通過檢索疾病基因相關(guān)數(shù)據(jù)庫，并搜集前期研究和報道共獲得與DN發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的已知的相關(guān)靶點基因113個，其中TTD、DrugBank、OMIM、GAD、Pharm GKB數(shù)據(jù)庫分別檢索到23、2、43、62、3個。

2.4丹參治療DN的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選分析

2.4.1 丹參治療DN的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 通過插件“BisoGenet”對丹參入血活性成分的作用靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建可知，與其產(chǎn)生直接或間接作用的靶點共5 896個，而這些靶點與靶點之間的相互關(guān)系多達131 478個；而與DN疾病相關(guān)靶點多達2 842個，靶點與靶點相互關(guān)系55 643個。

2.4.2 丹參治療DN的關(guān)鍵靶點篩選分析 通過Cytoscape對上述繪制的2個PPI網(wǎng)絡(luò)圖抽取交集網(wǎng)絡(luò)，采用CytoNCA根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的拓撲屬性篩選共發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點112個。見篩選策略示意圖3。

圖2 丹參“活性成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Compound-target network of Radix Salviae Miltiorrhizae

圖3 丹參治療DN關(guān)鍵節(jié)點的目標篩選策略圖Figure 3 Target screening strategy for key nodes of Radix Salviae Miltiorrhizae for the treatment of DN

2.4.3 丹參治療DN的機制分析 本研究利用ClueGO對上述關(guān)鍵節(jié)點進行富集分析，結(jié)果顯示，丹參作用于DN的關(guān)鍵節(jié)點涉及的信號通路，去除過于寬泛的信號通路，獲得26條被顯著富集的信號通路；按照其顯著程度排序依次為雌激素信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、甲狀腺激素信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信號通路、ErbB信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、催乳素信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路、B細胞受體信號通路、核因子kappaB（NF-κB）信號通路、T細胞受體信號通路、Ras信號通路、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞家族蛋白（Fox O）信號通路、趨化因子信號通路、白細胞介素17（IL-17）信號通路、Toll樣受體信號通路、胰島素（Insulin）信號通路、Wnt信號通路、Hippo信號通路、GnRH信號通路、Adipocytokine信號通路、cAMP信號通路、Notch信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路及轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路。通路富集分析見圖4、圖5。

3 討論

目前DN是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一，是世界范圍內(nèi)終末期腎病的主要原因，臨床上以蛋白尿和腎臟的形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變?yōu)樘卣鱗22]。DN發(fā)病機制復(fù)雜，涉及高血糖、糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）、血流動力學(xué)紊亂、代謝異常、炎癥因子和氧化應(yīng)激。雖然目前對DN的認識不斷增加，但除了控制血糖、血脂水平和高血壓之外，仍缺乏專門針對DN發(fā)病機制的治療策略。因此，大多數(shù)DN患者的預(yù)后較差，尤其是晚期DN患者。如診治延誤，發(fā)展到腎病末期，則只能采用透析甚至是腎移植[23，24]。

中醫(yī)藥憑借整體觀念和辨證論治理論，在治療DN中研究發(fā)揮著重要的作用[25]。DN屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”、“水腫”、“尿濁”和“關(guān)格”等范疇，《圣濟總錄》云：“消渴病久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，氣化失常，開闔不利，能為水腫?！北驹鹤灾苿┑⒔堤欠街委烡N取得了良好的臨床療效，丹參作為君藥發(fā)揮至關(guān)重要的作用，但其作用機制尚不明確，故基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測丹參單味中藥在DN的作用機制和關(guān)鍵通路。

本研究篩選丹參中入血的活性成分65個，模擬預(yù)測103個可能的靶點和1 349個相互關(guān)系?！盎钚猿煞帧悬c”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，丹參酮類、丹參螺旋縮酮內(nèi)酯、新隱丹參酮、丹參二醇、木犀草素、多孔甾醇、紫丹參戊素等有效成分能作用于網(wǎng)絡(luò)中的多個靶點，而IL-2、細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、雌激素受體1（ESR1）等靶點也能與多個成分作用?；谏鲜鼋Y(jié)果可知，丹參的入血活性成分不僅存在協(xié)同關(guān)系，而且其調(diào)控的靶點在DN病理進程中起著關(guān)鍵作用。

圖4 丹參治療DN信號通路富集分析網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 Enrichment analysis of the signaling pathway of Radix Salviae Miltiorrhizae for the treatment of DN

圖5 丹參治療DN信號通路富集分析標注圖Figure 5 Enrichment analysis label of the signaling pathway of Radix Salviae Miltiorrhizae for the treatment of DN

網(wǎng)絡(luò)拓撲分析是提取關(guān)鍵靶點的過程，本研究分別通過預(yù)測活性成分作用靶點和疾病藥物靶點的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系加以映射，以探尋靶點間的直接作用和間接作用關(guān)系，結(jié)合靶點參數(shù)進行核心篩選，最大限度地接近藥物治療疾病的真實靶點。

針對關(guān)鍵靶點進行通路富集分析，研究結(jié)果顯示，丹參調(diào)控DN主要通過影響細胞增殖、細胞因子、炎癥反應(yīng)、內(nèi)分泌代謝等多種因素和多通路，且上述通路與目前治療機制類似，主要表現(xiàn)在：①雌激素信號通路：雌二醇通過激活酪氨酸激酶2，抑制TGF-β的合成，從而抑制膠原蛋白ⅣRNA的轉(zhuǎn)錄，降低膠原蛋白的表達，最終降低了DN纖維化的程度[26]；②神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路：神經(jīng)營養(yǎng)因子參與因糖尿病造成的神經(jīng)系統(tǒng)病變的修復(fù)工作，改善DN相關(guān)癥狀[27]；③甲狀腺激素受體信號通路：DN患者常伴隨甲狀腺功能的減退，甚至出現(xiàn)低三碘甲狀腺原氨酸（T3）綜合征，血清游離三碘甲腺原氨酸（FT3）指標高低與DN預(yù)后好壞呈正相關(guān)，F(xiàn)T3可能是DN患者預(yù)后的關(guān)鍵預(yù)測指標[28]；④ErbB信號通路與PI3K-Akt信號通路：ErbB是PI3K-Akt重要的上游通路，而PI3K-Akt是保腎藥物作用與抑制細胞凋亡的關(guān)鍵通路[29]；⑤MAPK信號通路：p38MAPK被多種上游病理因素激活后可誘導(dǎo)下游炎癥細胞活化，導(dǎo)致DN腎組織損傷[30]；⑥HIF-1信號通路：DN早期存在缺氧環(huán)境，使腎組織缺氧誘導(dǎo)因子lα（HIF-1α）表達增加而調(diào)控內(nèi)皮素1（ET-1）的表達來參與DN病理進程[31]；⑦NF-κB、Adipocytokine、IL-17、趨化因子和Toll樣受體信號通路：多種炎性因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可造成血管內(nèi)皮功能減退和腎小球內(nèi)皮細胞與神經(jīng)細胞等損害，這可能是導(dǎo)致DN的重要因素之一[32]；⑧Ras信號通路：腎素—血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在腎臟的異常極有可能是DN腎血流動力學(xué)病變的重要因素[33]；⑨叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O（FoxO）信號通路：Fox O1作為胰島素與生長因子信號通路重要因子在調(diào)控糖脂代謝、細胞周期以及氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用[34]；⑩Insulin信號通路：糖尿病患者的胰島素敏感性受損與腎臟細胞葡萄糖代謝的改變有關(guān)，即使在血壓、血糖正常的情況下，胰島素抵抗機制依然可以推進DN蛋白尿病程發(fā)展[35]；○11Wnt和TGF-β信號通路：TGF-β 1和Wnt/β-catenin可能存在某種相互關(guān)聯(lián)的協(xié)同作用持續(xù)推進DN腎間質(zhì)纖維化的進程[36]；○12環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號通路：通過調(diào)節(jié)腸道三磷酸腺苷（ATP）和cAMP水平來調(diào)控胰高血糖素樣肽1（GLP-1）的釋放，從而發(fā)揮優(yōu)良的降糖作用[37]；○13 Notch信號通路：被激活后可加重腎小球基底膜變厚、系膜擴張和DN纖維化[38]；○14TNF信號通路：TNF-α能促進炎性細胞聚集與粘附，擴張微血管并增加其通透性，通過誘導(dǎo)炎性反應(yīng)最終損害腎小球組織，刺激IL-6參與微血管病變[39]。

綜上所述，丹參調(diào)控DN的作用機制主要涉及細胞增殖、分化及凋亡，調(diào)節(jié)糖脂代謝、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等保護腎小球濾過屏障，減輕腎損傷；通路之間彼此存在著復(fù)雜而又微妙的關(guān)聯(lián)，協(xié)同與拮抗作用共存，這很可能是中醫(yī)藥治療本病的特點——標本兼治、雙向調(diào)節(jié)，也闡明了中醫(yī)藥的多通路多靶點綜合干預(yù)的可行性與治療特色?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)分析能有效地揭示丹參治療DN可能的作用機制，為后續(xù)進一步臨床和實驗研究設(shè)計等提供了重要的理論依據(jù)，也為DN的治療指明了新的方向。

本研究仍存在一些不足，主要表現(xiàn)在：①未減少藥物成分的相互干擾，僅分析了本方中君藥丹參的作用；②未針對糖尿病腎病不同階段的病理狀態(tài)進行亞組分析；③尚未對預(yù)測獲得的關(guān)鍵靶點和通路進行實驗驗證。后續(xù)本課題將結(jié)合上述結(jié)果和前期研究數(shù)據(jù)進行更深一步的分子機制研究及臨床驗證。