劉紅英， 王協(xié)奇， 袁麗娜， 劉影， 彭燕， 羅碧怡， 何青蓮

（1.廣東省中醫(yī)院病理科，廣東廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510006）

肝細胞癌（HCC）是最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前臨床上針對HCC的西醫(yī)治療方法主要有放療、化療、介入治療、手術切除、肝移植等。其中，手術切除和肝移植被認為是最有效的治療方法，但在臨床上只有15%的患者符合肝切除及肝移植的條件[2]；而傳統(tǒng)的化療常因出現(xiàn)腫瘤細胞的耐藥性導致HCC療效不佳[3]。因此，尋找安全有效的治療HCC的方法對改善肝癌患者生活質量具有重要的臨床意義。近年來，從中藥中尋找生物活性成分應用于腫瘤治療備受廣泛關注。

穿心蓮，味苦性寒，歸肺、胃、大腸和小腸經，具清熱解毒燥濕之功。穿心蓮內酯（andrographolide，Andro）是藥用植物穿心蓮的主要有效成分之一[4]，為二環(huán)雙萜內酯類化合物。Andro具有抗氧化、抗炎、免疫調節(jié)、抗腫瘤等藥理學作用[5，6]。文獻報道，Andro 對結腸癌[7]、乳腺癌[8]、非小細胞肺癌[9]、胰腺癌[10]、黑色素瘤[11]等有很強的抗腫瘤作用，其抗腫瘤機制與細胞周期阻滯[12]、誘導凋亡與自噬[13]、抗血管新生[14]、抑制腫瘤細胞遷移、增加腫瘤細胞對放化療的敏感性[7，9]等有關。基于此，本研究以人肝癌細胞MHCC97H為體外細胞模型，觀察Andro對MHCC97H細胞增殖的影響及其機制，探討其體外抗肝癌作用，為其臨床應用于HCC的治療提供理論基礎。現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑Andro（美國Sigma公司，批號：365645）。四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Sigma公司）；RPMI 1640（美國Gibco公司）；Bax（美國Abcam公司）；Bcl-2、裂解型胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3）、周期素B1（cyclin B1）、周期素依賴性激酶1（CDK1）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR（Ser2448）、p70核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）、p-p70S6K（Thr389）、β-actin（美國Cell Signaling Technology公司）；剪切型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved-PARP）（美國eBioscience公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒、細胞周期分析試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術有限公司）。

1.2主要儀器細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BioTekELx800TM通用酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；CytomicsTMFC 500流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；Molecular Imager Chemi Doc XRS成像儀（美國Bio-Rad公司）；TE2000-U倒置相差熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3MTT法檢測細胞增殖以每孔5 000個細胞量將MHCC97H細胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后，按實驗要求加入終濃度（物質的量濃度）為5、10、20、30、40、50 μmol/L的Andro[Andro粉末先用DMSO溶解，再用培養(yǎng)基稀釋至細胞處理濃度，控制DMSO的含量為0.1%（v/v）]，并設立溶劑對照組（僅用0.1%DMSO溶劑）以及空白孔。每組設5個平行孔。于24、48、72 h檢測不同濃度的Andro對MHCC97H細胞的增殖作用，檢測時每孔加入MTT（5 mg/mL）工作液20 μL，37 ℃孵育4 h后，棄培養(yǎng)基，加入DMSO溶解，并通過酶標儀檢測490 nm處吸光度[D（λ）]。實驗獨立重復3次。計算MHCC97H細胞增殖率，細胞增殖率（p）=[Andro組D（λ）值-空白組D（λ）值]/[對照組D（λ）值-空白組D（λ）值]×100%。

1.4 Annexin V-PI雙染法檢測細胞凋亡將細胞密度為1×105個/mL的MHCC97H細胞接種于6孔板中，貼壁后，用25、50 μmol/L Andro分別處理細胞12、24、48 h。同時設立溶劑對照組（僅用0.1%DMSO溶劑）。收集細胞后，用冷PBS洗細胞2次，并用binding buffer重懸。加入AnnexinV-FITC及碘化丙啶（PI）試劑，在暗處孵育5 min后，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗獨立重復3次。

1.5 Hoechst 33342染色法檢測細胞凋亡將細胞密度為1×105個/mL的MHCC97H細胞接種于12孔板中，貼壁后，用25、50 μmol/L Andro處理細胞48 h，同時設立溶劑對照組（僅用0.1%DMSO溶劑）。加入10 μL Hoechst 33342（5 mg/mL）染液，10 min后，細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2次后，在熒光顯微鏡下觀察，拍照。實驗獨立重復3次。

1.6流式細胞術檢測細胞周期取細胞密度為1×105個/mL的MHCC97H細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁并饑餓處理12 h后，實驗組加入25、50 μmol/L Andro，同時設立溶劑對照組（僅用0.1%DMSO溶劑）。培養(yǎng)12、24、48 h后，收集所有細胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清后，用PBS溶液清洗1次，用200 μL PBS重懸細胞后，加入體積分數(shù)75%冰乙醇5 mL混勻固定，4℃固定12 h。檢測前，將細胞離心后棄乙醇，用PBS清洗1次，用binding buffer輕輕重懸后，加入PI試劑，室溫避光孵育15 min后，采用流式細胞儀檢測細胞周期分布。實驗獨立重復3次。

1.7蛋白質免疫印跡（Western blot）實驗將細胞密度為1×105個/mL的MHCC97H細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入50 μmol/L Andro，同時設立溶劑對照組（僅用0.1%DMSO溶劑）。處理48 h后，棄培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗3次，加入適量的含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，然后以4℃、15 000×g離心10 min，收集上清液。用BCA法精確測量蛋白質含量后，應用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后轉膜。膜在50 g/L脫脂牛奶室溫搖床孵育1 h，TBST（pH=7.6）清洗3次，5 min/次，分別加入稀釋的Bax（1∶2 000），Bcl-2（1∶1 000），cleaved-caspase-3（1∶1000），cleaved-PARP（1∶1000），cyclin B1（1∶1 000），CDK1（1∶1 000），mTOR（1∶2 000），p-mTOR（1∶2 000），p70S6K（1∶2 000），p-p70S6K（1∶2 000）、β-actin（1∶10 000）抗體，4℃孵育過夜后，TBST清洗3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，再用TBST清洗3次，5 min/次，ECL法顯色。應用Image Lab 5.2.1軟件分析Western blot條帶灰度值，數(shù)據結果以目的蛋白與內參蛋白（βactin）灰度值比值（p）表示。

1.8統(tǒng)計方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件和GraphPad Prism 5軟件，實驗數(shù)據以均數(shù)±標準差（±s）表示，Andro組與對照組的統(tǒng)計學分析采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。IC50值通過量效曲線采用非線性回歸分析計算得出。

2 結果

2.1Andro對MHCC97H細胞增殖的影響表1結果顯示，與溶劑對照組比較，Andro 5、10、20、30、40、50 μmol/L 組 24、48、72 h MHCC97H 細胞增殖率下降，且隨著Andro物質的量濃度、處理時間的增加而逐漸降低，提示Andro對MHCC97H細胞增殖的抑制作用隨著Andro濃度的增加及作用時間的延長而增強。由非線性回歸分析得到Andro在 24、48、72 h的 IC50值分別為（61.31±4.44）μmol/L、（31.55±3.67）μmol/L、（22.05±3.06）μmol/L。

表1 不同Andro濃度不同處理時間對MHCC97H細胞增殖的影響Table 1 The effect of Andro with different concentrations on the proliferation of MHCC97H cells after treatment for different time （±s）

表1 不同Andro濃度不同處理時間對MHCC97H細胞增殖的影響Table 1 The effect of Andro with different concentrations on the proliferation of MHCC97H cells after treatment for different time （±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，與溶劑對照組比較

組別溶劑對照組Andro 5 μmol/L組Andro 10 μmol/L組Andro 20 μmol/L組Andro 30 μmol/L組Andro 40 μmol/L組Andro 50 μmol/L組細胞增殖率（p/%）t=72 h 100.0±5.2 95.1±8.0 83.0±2.5②50.5±10.7②34.9±15.1②21.5±4.9③7.1±1.1③t=24 h 100.0±7.2 107.6±18.4 106.8±17.0 94.8±5.0 80.6±5.4②81.1±2.1③68.8±14.8①t=48 h 100.8±11.3 106.9±5.4 91.8±10.5 70.9±9.0②61.2±15.4①46.7±20.4①16.6±5.2③

2.2Andro對MHCC97H細胞凋亡的影響流式細胞術結果顯示，與溶劑對照組比較，Andro 25、50 μmol/L組12、24、48 h MHCC97H細胞凋亡率均升高，呈時間和劑量依賴性，其中Andro 50 μmol/L組24、48 h MHCC97H細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.001），見圖1。Hoechst 33342染色結果也顯示，Andro 25、50 μmol/L組48 h細胞凋亡率較溶劑對照組顯著升高（P＜0.05）。見圖2。2項研究結果表明Andro可以促進MHCC97H細胞凋亡，提示Andro對MHCC97H細胞增殖的抑制作用可能與其促細胞凋亡作用有關。

2.3Andro對MHCC97H細胞周期的影響表2、圖3結果顯示，50 μmol/L Andro作用MHCC97H細胞48 h后，G2/M期細胞數(shù)量為（19.9±2.5）%，而溶劑對照組G2/M期細胞數(shù)量為（8.0±2.0）%，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.001）。表明Andro可使MHCC97H細胞阻滯于G2/M期。

2.4Andro對MHCC97H細胞凋亡及周期相關蛋白表達的影響表3、圖4結果顯示：（1）凋亡相關蛋白：與溶劑對照組比較，Andro 50 μmol/L組中促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達升高（P＜0.05或P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低（P＜0.01）。表明Andro可促進MHCC97H細胞凋亡。（2）周期相關蛋白：與溶劑對照組比較，Andro 50 μmol/L組MHCC97H細胞中周期蛋白cyclin B1和CDK1表達均下降（P＜0.05），提示Andro可能通過下調cyclin B1和CDK1的表達誘導MHCC97H細胞發(fā)生G2/M期周期阻滯。

圖1 不同Andro濃度不同處理時間對MHCC97H細胞凋亡的影響Figure 1 The effect of Andro with different concentrations on the apoptosis of MHCC97H cells after treatment for different time

圖2 不同濃度Andro處理48 h對MHCC97H細胞凋亡的影響Figure 2 The effect of Andro with different concentrations on the apoptosis of MHCC97H cells after treatment for 48 h

表2 不同濃度Andro不同處理時間對MHCC97H細胞周期的影響Table 2 The effect of Andro with different concentrations on MHCC97H cell cycle after treatment for different time （±s）

表2 不同濃度Andro不同處理時間對MHCC97H細胞周期的影響Table 2 The effect of Andro with different concentrations on MHCC97H cell cycle after treatment for different time （±s）

①P＜0.01，②P＜0.001，與同時間對應周期溶劑對照組比較

細胞數(shù)量（p/%）t=48 h 51.3±6.2 43.0±9.4 8.0±2.0 54.6±4.0 41.6±2.3 5.4±0.3 44.1±1.4 36.1±2.0 19.9±2.5①組別溶劑對照組Andro 25 μmol/L組Andro 50 μmol/L組細胞周期G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M t=12 h 44.8±1.9 34.8±4.8 20.3±3.3 44.5±2.7 37.3±3.6 18.2±2.9 38.1±2.1 40.2±4.1 21.7±5.8 t=24 h 64.3±3.7 26.4±4.1 9.2±0.5 62.9±5.3 27.4±3.8 9.7±1.5 48.5±3.4②31.8±3.7 22.4±0.7②

2.5Andro對MHCC97H細胞中mTOR信號通路的影響圖5、表4結果顯示，Andro 50 μmol/L組mTOR、p70S6K的磷酸化水平較溶劑對照組下降（P＜0.01或P＜0.001）。

3 討論

肝細胞癌（HCC）因被發(fā)現(xiàn)被診斷時就已經處于晚期階段，導致高致死率。索拉非尼是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準的治療晚期HCC唯一的藥物，是一種多靶點抑制劑[15]，然而索拉非尼只對約30%的晚期肝癌患者有益，患者在6個月內往往會出現(xiàn)獲得性耐藥[16，17]，因此，迫切需要新的有效的治療策略。

中藥提取物在癌癥治療領域占據著重要的地位，Andro是中藥穿心蓮的主要生物活性成分。本研究結果顯示，Andro可抑制MHCC97H細胞的增殖，且呈濃度及時間依賴性。

圖3Andro對MHCC97H細胞周期的影響Figure 3 The effect of Andro on MHCC97H cell cycle

表3 Andro處理MHCC97H細胞后凋亡及周期相關蛋白的相對表達量Table 3 The relative expression of apoptosis-related proteins and cell-cycle-related proteins in MHCC97H cells treated with Andro （±s，p）

表3 Andro處理MHCC97H細胞后凋亡及周期相關蛋白的相對表達量Table 3 The relative expression of apoptosis-related proteins and cell-cycle-related proteins in MHCC97H cells treated with Andro （±s，p）

①P＜0.05，②P＜0.01，與溶劑對照組比較

組別溶劑對照組Andro 50 μmol/L組cleaved-PARP/β-actin 1.00±0.17 3.43±0.11②Bax/β-actin 1.00±0.09 2.65±0.16②Bcl-2/β-actin 1.00±0.19 0.52±0.19②cleaved-caspase-3/β-actin 1.00±0.12 1.98±0.08①cyclin B1/β-actin 1.00±0.07 0.64±0.13①CDK1/β-actin 1.00±0.11 0.47±0.06①

圖4 凋亡及周期相關蛋白Western blot電泳條帶Figure 4 The Western blotting electrophoresis results of apoptosis related proteins and cell-cycle-related proteins

圖5mTOR信號通路蛋白mTOR、p70S6K Western blot電泳條帶Figure 5 The Western blotting electrophoresis results of mTOR signaling pathway proteins mTOR and p70S6K

表4Andro處理MHCC97H細胞后mTOR信號通路相關蛋白相對表達量Table 4 The relative expression of the proteins related with mTOR signaling pathway in MHCC97H cells treated with Andro （±s，p）

表4Andro處理MHCC97H細胞后mTOR信號通路相關蛋白相對表達量Table 4 The relative expression of the proteins related with mTOR signaling pathway in MHCC97H cells treated with Andro （±s，p）

①P＜0.01，②P＜0.001，與溶劑對照組比較

組別溶劑對照組Andro 50 μmol/L組p-p70S6K/p70S6K 1.00±0.06 0.35±0.07②p-mTOR/mTOR 1.00±0.09 0.63±0.09①

細胞凋亡是指細胞在生長發(fā)育過程或者是因為某一些因素中的影響，經過調節(jié)控制細胞內基因的一種與其產物相聯(lián)的程序性細胞死亡。越來越多的研究表明細胞凋亡異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用。近年來大量實驗研究表明，線粒體通路在細胞凋亡機制中起著至關重要的作用，在眾多的凋亡調控基因中，Bcl-2蛋白家族和胱天蛋白酶（caspase）家族目前最受關注，其中Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促進凋亡基因[18]，caspase-3則是凋亡過程中最關鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，活化后的caspase-3酶解切割DNA依賴的蛋白激酶（DNA-PK）和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶（PARP）等，從而影響DNA復制、轉錄和損傷修復[19]。細胞通過不斷的周期性分裂將自身的遺傳物質準確完整地傳遞給下一代。當出現(xiàn)DNA突變后，周期檢查點（cell cycle checkpoint）發(fā)揮作用使細胞周期停滯，修復DNA或者直接啟動凋亡，如果發(fā)生異變的細胞存活則會轉化為異常增殖的腫瘤細胞。細胞周期檢查點是細胞周期調控的關鍵部位，它決定了DNA復制及細胞分裂。由細胞周期蛋白（cyclin）、細胞周期素依賴蛋白激酶（CDK）及其抑制因子（CKI）組成的cyclin-CDK-CKI系統(tǒng)，共同形成了一個對細胞周期進行調控的生物學網絡，維持著細胞進行正常的有絲分裂。其中cyclin B/CDK1磷酸化調節(jié)機制的缺陷與細胞分化障礙具有明顯相關性，而細胞的分化障礙是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基本表型。當G2期出現(xiàn)DNA損傷時，檢測點激酶1/2（Chk1/2）以毛細血管擴張共濟失調突變（ATM）依賴的方式被激活，可磷酸化細胞分裂周期25蛋白磷酸酯酶（CDC25）從而抑制其活性，進而抑制CDK1的去磷酸化作用，使其處于抑制狀態(tài)，CDC25與14-3-3σ蛋白相互作用，使cyclin B1/CDK1復合物進入細胞核受阻，故阻止細胞周期的進行[20]。

為探討Andro對MHCC97H細胞增殖的抑制作用是否與細胞凋亡相關及對細胞周期的影響，本研究采用Annexin V-PI法及Hoechst 33342染色法觀察細胞凋亡情況，采用流式細胞術檢測細胞周期分布情況。本研究結果顯示，Andro組MHCC97H細胞凋亡率升高，G2/M期細胞數(shù)量增加，表明Andro可促進細胞凋亡，并使細胞阻滯于G2/M期。細胞周期中G2/M檢查點也稱為DNA損傷檢查點，其主要作用是確保細胞在S及G2期經歷所有必要的變化，并為細胞分裂做好準備，當細胞發(fā)生G2/M周期阻滯時，將會抑制細胞的增殖。為進一步探討Andro誘導的細胞凋亡和細胞周期阻滯作用，本研究采用蛋白免疫印跡方法檢測凋亡及周期相關蛋白表達，結果顯示，Andro可使MHCC97H細胞周期蛋白cyclin B1和CDK1表達下降，促凋亡蛋白Bax、cleaved-PARP、cleavedcaspase-3表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低。表明Andro促進MHCC97H細胞凋亡并在G2/M期發(fā)生細胞周期阻滯的機制可能與其對MHCC97H細胞凋亡相關蛋白Bax、cleaved-PARP、cleavedcaspase-3、Bcl-2及周期相關蛋白cyclin B1、CDK1表達的調控有關。

mTOR-p70S6K信號通路作為細胞內非常重要的信號轉導途徑，在細胞的增殖、凋亡、細胞周期、血管生成、自吞噬等過程中發(fā)揮著極其重要的生物學功能，該通路的紊亂會引起包括癌癥在內的一系列的疾病[21]。mTOR在細胞的生長、增殖中起重要作用。mTOR在兩個結構及功能不同的蛋白復合體中起作用，包括mTORC1及mTORC2[21]。作為mTOR復合體的一部分，mTOR可直接激活p70S6K以及對其Thr389位點的磷酸化。p70S6K在調節(jié)細胞生長、細胞周期進程和細胞增殖中起著明顯的重要作用[22，23]。研究報道指出Andro可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路來誘導白血病細胞U937細胞凋亡與自噬[13]。然而目前，對于Andro是否能通過抑制mTOR途徑來抑制肝癌細胞的生長仍不清楚。本研究結果顯示Andro可降低mTOR、p70S6K的磷酸化水平，提示Andro可抑制mTOR-p70S6K信號通路的活性。

綜上所述，Andro可能通過調控MHCC97H細胞凋亡相關蛋白Bax、cleaved-PARP、cleavedcaspase-3、Bcl-2及周期相關蛋白cyclin B1、CDK1的表達及抑制mTOR-p70S6K信號通路的激活，促進細胞凋亡，使細胞周期發(fā)生阻滯，從而發(fā)揮體外抗肝癌作用。