林基偉， 劉新輝， 吳海濱， 宋曉容， 程波敏， 古煬暉， 汪棟材

（1.深圳市中醫(yī)院治未病中心，廣東深圳 518000；2.深圳市中醫(yī)院腎病科，廣東深圳，518000；3.深圳市中醫(yī)院心血管科，廣東深圳 518000）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患者最常見的死因[1，2]。臨床研究表明，CKD患心血管疾病的風險顯著升高，其部分原因可能是過度的血管（動脈）鈣化（vascular calcification，VC）。目前針對血管鈣化尚無特異性療法，一般采取相應措施建立凈鈣平衡，但尚無質(zhì)量良好的數(shù)據(jù)表明此類操作可減輕血管鈣化。中醫(yī)藥在治療和延緩血管鈣化方面具有一定的療效。黃芪和丹參是中醫(yī)臨床治療心血管疾病的常用藥對。黃芪益氣補虛，側重扶正固本，丹參專攻活血化瘀，兩者配伍與中醫(yī)學“氣為血之帥”、“血為氣之母”等理論相吻合，起到協(xié)同作用。有研究表明，這2味中藥的有效成分在心血管系統(tǒng)方面均有一定的藥理學效用，其中黃芪皂苷[3]能夠減輕鈣化大鼠血管脂質(zhì)過氧化損傷及血管平滑肌細胞凋亡，丹參酮[4]可通過調(diào)控FGF23-Klotho軸改善動脈內(nèi)膜中層厚度，抑制血管鈣化。本研究通過構建腺嘌呤誘導慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF；以下簡稱“腎衰”）大鼠模型，觀察黃芪—丹參配伍對其心血管鈣化變化的影響，從而了解黃芪—丹參對腎衰大鼠的腎臟、心血管病變的調(diào)控作用，以期探索早中期CKD并發(fā)CVD的有效中醫(yī)藥防治措施，對改善慢性腎衰疾病的預后有重要意義，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級8周齡雄性大鼠25只，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（粵）2013-0002。飼養(yǎng)大鼠于廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院，飼養(yǎng)條件：12 h光照，室溫20～25℃，相對濕度50%～70%，自由攝水、飲食。飼料[含腺嘌呤0.75%（質(zhì)量分數(shù)）]購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

1.2實驗藥物黃芪—丹參水煎提取液（黃芪與丹參的比例為2∶1），由深圳市中醫(yī)院中藥制劑中心提供。培哚普利叔丁胺片（施維雅天津制藥有限公司，批號：H20034053）。

1.3試劑與儀器丙氨酸氨基轉移酶（ALT）測定試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）測定試劑盒、血肌酐（SCr）測定試劑盒、血尿酸（SUA）測定試劑盒、鈣（Ca2+）測定試劑盒及堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒（長春匯力生物技術有限公司）；大鼠成纖維細胞生長因子23（FGF-23）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。電子天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]；超聲細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；臺式高速冷凍離心機[Heal Force（上海）有限公司]；純水儀（青島富勒姆科技有限公司）；超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）；水浴鍋（姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司）；渦旋混合器、全自動研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；酶標檢測儀（美國BioTek公司）；RT-6100酶標分析儀、全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技有限公司）。

1.4動物分組、造模及給藥干預所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，將25只大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機分為5組，即空白組、模型組、培哚普利組、黃芪—丹參低劑量組、黃芪—丹參高劑量組，每組5只。參照Thakur R等[5]的研究方法復制腎衰大鼠模型，預實驗結果顯示，SCr水平升高。各造模組大鼠喂食含質(zhì)量分數(shù)為0.75%腺嘌呤的飼料，持續(xù)4周；空白組以基礎飼料喂養(yǎng)。各給藥組在造模同時開始給藥干預。按照大鼠與人等效劑量換算各給藥組劑量：培哚普利組給予培哚普利叔丁胺片（劑量為0.42 mg·kg-1·d-1）灌胃，黃芪—丹參低劑量組給予黃芪—丹參水煎提取液（劑量為1.0 g·kg-1·d-1）灌胃，黃芪—丹參高劑量組組給予黃芪—丹參水煎提取液（劑量為4.0 g·kg-1·d-1）灌胃。持續(xù)4周。

1.5觀察指標與方法

1.5.1 體質(zhì)量、左心室指數(shù) 干預4周后，對大鼠麻醉后稱量體質(zhì)量。開胸剪取心臟，用4℃預冷生理鹽水沖洗血污，濾紙吸干后稱全心質(zhì)量；去除心房、大血管和右心室游離壁，分離左心室，稱量左心室質(zhì)量，計算左心室指數(shù)，評判左心室重構程度，了解腎臟損傷后繼發(fā)的心臟結構代償反應。左心室指數(shù)（w）=左心室質(zhì)量（g）/心臟質(zhì)量（g）。

1.5.2 肝腎功能及血尿酸檢測 采用全自動生化儀器檢測大鼠肝腎功能（ALT、AST、SCr及SUA）。ALT及AST檢測方法為速率法，檢測波長340 nm。SCr檢測方法為終點法，檢測波長630 nm。SUA檢測方法為終點法，檢測波長為510 nm。通過檢測ALT、AST、SCr及SUA，評估腺嘌呤對大鼠肝、腎功能的損傷程度。

1.5.3 主動脈組織Ca2+、ALP含量檢測 取適量大鼠胸腔降主動脈組織，用9倍生理鹽水研磨，然后將研磨液3 000～4 000 r/min離心10 min，取上清檢測。終點法檢測Ca2+，檢測波長為660 nm。速率法檢測ALP，檢測波長為405 nm。

1.5.4 血清FGF-23檢測 具體步驟按照FGF-23 ELISA檢測試劑盒說明書進行操作：①加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣時，將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。②溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。③配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。④洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。⑤加酶：每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。⑥顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min。⑦終止：每孔加終止液50 μL，終止反應（此時藍色立轉黃色）。⑧測定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度[D（λ）]。在加終止液后15 min以內(nèi)進行測定。

1.6統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠一般狀況比較對各組大鼠進行相應的4周干預后，模型組大鼠食欲有所減退，皮毛光澤度明顯下降，神態(tài)倦怠，活動減少。黃芪—丹參干預組的大鼠一般情況較前好轉，較為活躍。空白組大鼠活動、飲食基本正常。體質(zhì)量比較結果顯示：與空白組比較，其余各組大鼠體質(zhì)量均降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠體質(zhì)量均無明顯變化（P＞0.05）。左心室指數(shù)結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠左心室指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，培哚普利組左心室指數(shù)明顯降低（P＜0.05），黃芪—丹參高、低劑量組左心室指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、左心室指數(shù)比較Table 1 Comparison of the body mass and the left ventricle index in various groups （±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、左心室指數(shù)比較Table 1 Comparison of the body mass and the left ventricle index in various groups （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組培哚普利組黃芪—丹參低劑量組黃芪—丹參高劑量組左心室指數(shù)[w/（g·g-1）]0.588±0.055 0.669±0.028①0.592±0.488②0.666±0.024 0.670±0.029 N 5 5 5 5 5 4周后體質(zhì)量（m/g）365.20±15.96 262.00±14.34①259.00±15.28①273.40±14.81①272.40±14.45①

2.2各組大鼠肝腎功能及SUA水平比較表2結果顯示：與空白組比較，其他各組大鼠ALT、AST、SUA均無顯著性差異（P＞0.05）。與空白組比較，模型組大鼠SCr水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪—丹參高、低劑量組及培哚普利組大鼠SCr水平顯著降低（P＜0.05）；與培哚普利組比較，黃芪—丹參高劑量組SCr水平顯著降低（P＜0.05）。

2.3各組大鼠主動脈組織Ca2+、ALP含量比較表3結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠主動脈組織Ca2+含量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪—丹參高、低劑量組及培哚普利組Ca2+含量無顯著差異（P＞0.05）。與空白組比較，模型組大鼠主動脈組織ALP含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪—丹參高、低劑量組及培哚普利組ALP含量明顯降低（P＜0.05）；與培哚普利組比較，黃芪—丹參高、低劑量組ALP含量顯著升高。

表2 各組大鼠肝腎功能及SUA水平比較Table 2 Comparison of hepatorenal function indexes and SUA level in various groups （±s）

表2 各組大鼠肝腎功能及SUA水平比較Table 2 Comparison of hepatorenal function indexes and SUA level in various groups （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與培哚普利組比較

組別空白組模型組培哚普利組黃芪—丹參低劑量組黃芪—丹參高劑量組SUA[c/（μmol·L-1）]143.82±17.54 178.34±65.59 192.60±42.94 131.62±7.88 129.27±5.36 N55555 AST[J/（U·L-1）]95.66±14.09 88.53±11.12 91.21±12.17 77.06±7.95 77.86±10.76 ALT[J/（U·L-1）]29.52±3.78 26.50±5.65 28.83±12.08 26.33±5.68 22.34±3.26 SCr[c/（μmol·L-1）]121.83±16.16 308.85±73.14①241.17±15.09②201.20±28.82②161.65± 10.68②③

表3 各組大鼠主動脈組織Ca2+、ALP含量比較Table 3 Comparison of the contents of Ca2+and ALP in aortic tissues of various groups （±s）

表3 各組大鼠主動脈組織Ca2+、ALP含量比較Table 3 Comparison of the contents of Ca2+and ALP in aortic tissues of various groups （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與培哚普利組比較

ALP[J/（U·g-1）]231.38±103.89 442.11±93.09①124.46±65.35②268.48± 64.15②③272.77± 52.94②③組別空白組模型組培哚普利組黃芪—丹參低劑量組黃芪—丹參高劑量組N 5 55 5 5 Ca2+[b/（mmol·g-1）]3.84±0.35 3.00±0.56①2.49±0.50①2.78±0.40①2.98±0.55①

2.4各組大鼠血清FGF-23水平比較表4結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血清FGF-23水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪—丹參高、低劑量組及培哚普利組血清FGF-23水平顯著降低（P＜0.05）；與培哚普利組比較，黃芪—丹參高、低劑量組血清FGF-23水平明顯降低（P＜0.05）。

表4 各組大鼠血清FGF-23水平比較Table 4 Comparison of serum FGF-23 levels in various groups （±s）

表4 各組大鼠血清FGF-23水平比較Table 4 Comparison of serum FGF-23 levels in various groups （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與培哚普利組比較

FGF-23[（ρ/（pg·mL-1）]43.83±8.84 107.11±4.54①86.54±9.43②69.26± 4.79②③53.94± 7.88②③組別空白組模型組培哚普利組黃芪—丹參低劑量組黃芪—丹參高劑量組N55555

3 討論

慢性腎臟?。–KD）患者早期即可出現(xiàn)礦物質(zhì)代謝和骨結構改變。其并發(fā)血管和其他軟組織鈣化時，符合慢性腎臟病礦物質(zhì)和骨異常（CKDMBD）診斷。與血管鈣化相關聯(lián)的系列并發(fā)癥是CKD患者的主要死因。積極干預鈣化危險因素，對于減少CKD患者心血管事件發(fā)生，提高生活質(zhì)量有重要意義[6]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學對于CKD繼發(fā)的血管鈣化尚無特異性治療方法。黃芪—丹參是防治心血管系統(tǒng)疾病的有效藥對[7]。有研究表明，黃芪注射液聯(lián)合復方丹參注射液治療心力衰竭患者有較好的臨床療效[8]；黃芪—丹參藥物組合能夠有效抑制脈粥樣硬化模型大鼠主動脈病變[9]。因此，本研究進一步觀察黃芪—丹參藥對腎衰大鼠血管鈣化的影響，以了解益氣通絡藥物對腎臟、心血管病變的調(diào)控作用，探索早中期CKD并發(fā)CVD的有效中醫(yī)藥防治措施。

本研究采用腺嘌呤喂飼法誘導腎衰大鼠模型，結果顯示模型組大鼠SCr值較空白組顯著升高，與既往報道結果[5]相一致；此外，一般指標結果提示，模型大鼠的體質(zhì)量較空白組明顯下降，左心室質(zhì)量分數(shù)明顯增高，亦與腎衰疾病指標相符合，均提示腎衰大鼠造模成功。經(jīng)黃芪—丹參干預后，腎衰大鼠的SCr水平顯著降低，表明黃芪—丹參配伍能有效改善腎衰大鼠腎功能。肝功能結果顯示，腺嘌呤誘導的腎衰大鼠肝臟功能未見明顯受損，提示可排除循環(huán)系統(tǒng)損傷是由肝功能衰竭引起。

在血管鈣化方面，腎衰模型大鼠主動脈Ca2+含量均表現(xiàn)為不同程度的降低，這與慢性腎衰病情變化特點相一致。在CKD臨床病程中，早期由于磷酸鹽潴留、骨化三醇濃度降低以及骨對PTH的血Ca2+調(diào)節(jié)作用的抵抗，導致人體Ca2+濃度降低[10]。循環(huán)總Ca2+量的降低，導致組織間的鈣池含量向循環(huán)池轉移，主動脈Ca2+含量也相應地降低。但本研究結果并無顯見的Ca2+沉積指標，既往有研究提示，主動脈完全鈣化沉積較周圍血管鈣化需要更長的腺嘌呤誘導時間[11]，那么，本次研究應用腺嘌呤雖已經(jīng)成功誘導大鼠腎衰模型，但若觀察腎衰繼發(fā)主動脈鈣化模型則可能需要延長造模時間。另外，本研究結果顯示，各治療組主動脈Ca2+含量組間比較未見到明顯差異，推測其可能與大鼠CKD早期狀態(tài)即進行藥物干預有關。

既往國外文獻報道，機體不斷增進的鈣化過程與高度活性的ALP有一定相關性[12]。在此次研究中，模型大鼠ALP水平較其他各組顯著增高，該結果與文獻[13]報道相一致。培哚普利、黃芪—丹參配伍治療均能有效降低大鼠的ALP水平。既往相關研究[14]提示，腎病疾病的血管鈣化組織，ALP的高表達可能與微炎癥狀態(tài)有關。

FGF-23是目前血管鈣化研究的熱點。FGF-23是一種在血清磷酸鹽濃度的控制中起關鍵作用的循環(huán)肽[15]，是由人體骨細胞和成骨細胞在骨化三醇、磷酸鹽負荷、PTH和Ca2+的作用下分泌的[16]。FGF-23作為CKD-MBD的敏感指標，是CKDMBD早期可檢測的生物標志物之一[17]，F(xiàn)GF-23較其他主動脈Ca2+含量變化更加明顯，F(xiàn)GF-23水平增加可在血清Ca2+、磷（P）改變之前出現(xiàn)。在CKD患者中，F(xiàn)GF-23水平與心血管疾病風險和死亡率增加有關[18]。本次研究結果顯示，模型組血清FGF-23表達較空白組明顯增加。既往有研究表明，腎臟在FGF-23的代謝中起著關鍵作用[19]。血FGF-23濃度的增加，可能因為CKD腎功能的減退，導致對FGF-23的清除減少所致[20]。而黃芪—丹參低、高劑量組及培哚普利組均能夠降低腎衰大鼠血清FGF-23水平，且高劑量的黃芪—丹參配伍降低FGF-23效果更明顯。

綜上所述，本研究結果提示黃芪—丹參藥對配伍能有效降低腎衰大鼠血清SCr、FGF-23水平。但因時間有限，本研究存在一些不足：①腺嘌呤誘導時間短，故腎衰動物模型未出現(xiàn)主動脈Ca2+沉積的病理表現(xiàn)；②干預時間短，故各治療組與模型組組間比較，Ca2+含量檢測未見顯著性差異，下一步研究有待延長黃芪—丹參藥對的干預時間。血清FGF-23正成為治療CKD-MBD的一個潛在靶目標。目前針對FGF-23尚無確切藥物。本研究顯示黃芪—丹參組合可下調(diào)FGF-23表達，故本課題組有待下一步針對FGF-23調(diào)控通路深入探討和研究黃芪—丹參組合相關血管鈣化的機制。