湯思哲，王 仆，孔大陸

(天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤科 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300060)

肝細胞肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，占惡性腫瘤死亡率第二位[1]。雖然其治療手段取得了很大進展，但復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率仍未下降，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率和術(shù)后復(fù)發(fā)率高。因此，尋求新的治療途徑是提高肝細胞肝癌治療效果的關(guān)鍵。人體組織中的細胞可能經(jīng)歷許多機械刺激，如來自血流的剪切應(yīng)力或來自與肌肉活動相關(guān)的幾種組織的拉伸和壓縮力[2]。細胞被細胞外基質(zhì)包圍，而細胞外基質(zhì)由許多不同的蛋白質(zhì)組成，包括層粘連蛋白、膠原蛋白和纖連蛋白。通過施加牽引力，細胞能感測到細胞外基質(zhì)固有的機械特性，如硬度。細胞對外力反應(yīng)的能力，包括探測和解讀細胞外基質(zhì)的機械特性及合成和重構(gòu)細胞外基質(zhì)，在許多方面發(fā)揮重要作用[3]。如細胞外基質(zhì)硬度在疾病狀態(tài)(如癌癥和纖維化)[4]或衰老[5]下會對細胞的遷移、分化和增殖產(chǎn)生不利影響。另一方面，細胞內(nèi)異常的信號通路會影響細胞感知和響應(yīng)外部機械刺激的能力，是造成癌癥、纖維化發(fā)展的重要原因，同時也是導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)疾病的始動因素。細胞感知和響應(yīng)外部機械刺激的能力被稱為機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)。機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)需要感知外力或生物力學(xué)特性并將該信息向后轉(zhuǎn)導(dǎo)，觸發(fā)特定的細胞內(nèi)信號響應(yīng)。而細胞骨架可將不同的細胞區(qū)域(高爾基體和細胞核)連接到力感知裝置，因此細胞骨架在機械轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[6]?，F(xiàn)就基質(zhì)硬度與肝細胞肝癌的相關(guān)研究進展予以綜述，以為臨床肝細胞肝癌的預(yù)防和治療提供參考。

1 機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)

自機械生物學(xué)概念出現(xiàn)以來，機械信號已被證明幾乎影響了生物學(xué)的每個過程[7]。體育鍛煉、呼吸或心臟泵血等大體機械信號在一個多世紀以前就被認為會調(diào)節(jié)組織發(fā)育，而微觀機械信號(如細胞產(chǎn)生的力或血流)對細胞黏附的影響于1980年后才得到證實[8]。隨著觀察和干預(yù)體外機械信號技術(shù)的出現(xiàn)，細胞如何感知、傳遞和調(diào)節(jié)機械信號機制逐漸被揭示[9]。

在細胞質(zhì)中，細胞骨架由肌動蛋白、中間細絲和微管組成，其高動態(tài)支架結(jié)構(gòu)是機械信號產(chǎn)生和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵單元。這些結(jié)構(gòu)成分的不斷聚合/解聚，以及肌球蛋白Ⅱ誘導(dǎo)的肌動蛋白絲運動，是產(chǎn)生活性力的原因。機械力可傳導(dǎo)至不同的通路：①通過核骨架和細胞骨架復(fù)合體直接施加在細胞核上[10]；②在膜和黏著斑上，通過整合素受體將它們傳遞穿過細胞膜并與細胞外基質(zhì)相互作用[9]；③通過黏附連接，其中鈣黏素受體可將這些力傳遞給鄰近的細胞[11]。沿著上述力作用的軸線，機械信號通過直接的細胞-胞接觸或通過細胞外基質(zhì)變形傳播。由于細胞骨架的相互連接結(jié)構(gòu)，機械力通過局部粘連或黏附連接，故會引發(fā)幾乎每個細胞器變形。細胞將這種來回形式的機械信號(力)轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎麅?nèi)的生化信號，調(diào)整細胞的行為和(或)表型[12]。因此，機械信號可理解為信息處理過程，即由細胞外基質(zhì)單元“寫入”，通過“傳輸”并由其他單元“讀取”的過程。與其他信息處理系統(tǒng)一樣，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的穩(wěn)定性和可重復(fù)性對細胞的穩(wěn)定性至關(guān)重要。機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)過程配備了許多正反饋回路，以完成高度復(fù)雜、精密和動態(tài)的水平分子反饋調(diào)節(jié)，故在細胞的生理及病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2 基質(zhì)硬度與機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)

細胞內(nèi)在的基因組改變和其對外在可溶性生長因子、細胞因子和趨化因子刺激的反應(yīng)可產(chǎn)生細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤的發(fā)生和演進可概括為包含多個中間步驟的由良性表型至獲得侵犯或轉(zhuǎn)移特性的過程，包括特定基因的擴增或失活、腫瘤標(biāo)志物的表達及細胞和組織結(jié)構(gòu)的改變等。同時，這些步驟還應(yīng)包括細胞和組織的力學(xué)表型。不僅包括細胞和組織結(jié)構(gòu)及力學(xué)的內(nèi)在變化，還包括細胞微環(huán)境的生物物理學(xué)特性改變，如細胞外基質(zhì)的力學(xué)、幾何學(xué)和拓撲學(xué)[13]。

組織硬度可影響許多生物學(xué)過程。人們觸到腫瘤是因為腫瘤本身硬度增加[14]。而研究表明，微環(huán)境中的力學(xué)變化可促進腫瘤演進[15]。纖維性肺疾病起初為輕度組織硬度的變化，其被細胞感知后可產(chǎn)生更加嚴重、不可復(fù)的重構(gòu)[16]。且細胞外環(huán)境的硬度可調(diào)控間充質(zhì)干細胞的分化和造血干細胞的自我更新[17-18]。開發(fā)力學(xué)特性上可調(diào)節(jié)的支架以控制細胞行為已成為組織工程的主要任務(wù)[19]。

在腫瘤學(xué)方面，研究主要集中于細胞外基質(zhì)的硬度變異如何影響組織細胞的行為。體外3D基質(zhì)的生物力學(xué)特性，特別是其壓力和張力，可對細胞行為產(chǎn)生重要影響，且可能對調(diào)控細胞和組織的行為與生物化學(xué)因素具有協(xié)同作用[20]。乳腺上皮細胞可在重構(gòu)的基膜基質(zhì)(Matrigel)中形成具有極性的乳腺腺泡，并可復(fù)制在體環(huán)境催乳激素刺激下發(fā)生的分化[21]。轉(zhuǎn)化事件可激活細胞侵犯腺泡腔，故整個系統(tǒng)可作為模擬腫瘤發(fā)生的模型[20]。研究表明，在不改變其生物化學(xué)組成的前提下，增加基膜基質(zhì)密度可發(fā)生乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)化[18]。其通過調(diào)節(jié)整合素和Rho激酶介導(dǎo)的信號通路發(fā)揮作用。這些力學(xué)改變可增加細胞生長、細胞極性消失、黏著斑增加、黏著斑激酶、vinculin和p130CAS激活，并導(dǎo)致細胞-細胞連接破壞從而阻止腺泡腔形成[22]。

以上研究表明，組織硬度與細胞表型關(guān)系密切，機制涉及機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)。機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)是指將物理信號轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)，其主要集中在已確定對力學(xué)敏感的分子，如離子通道、整合素、鈣黏素、生長因子受體、細胞骨架、細胞核、胞外基質(zhì)以及其他大量被認為在機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)之中發(fā)揮作用的信號分子。在物理因素的刺激作用下，上皮細胞表面的整合素是外力傳向細胞骨架的通道，細胞通過其表面的整合素受體即時響應(yīng)機械力以張力整合的形式將響應(yīng)的力信號有選擇地轉(zhuǎn)換到細胞和核內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)部件上，如黏著斑中的信號分子、細胞骨架結(jié)構(gòu)、細胞膜上的表皮生長因子受體、離子通道、核膜孔、染色體，甚至可能是單個基因，實現(xiàn)力化學(xué)轉(zhuǎn)化，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、黏附、遷移等生理功能，并引起胞形態(tài)學(xué)上的進一步變化，如極化、突起，最終導(dǎo)致細胞極性改變，這對維持細胞的鋪展和生長，影響細胞的功能產(chǎn)生調(diào)控作用[23]。

3 基質(zhì)硬度、肝硬化與肝細胞肝癌的關(guān)系

肝細胞肝癌發(fā)生和演進是多因素、多基因和多階段、多途徑的復(fù)雜過程，其確切分子生物學(xué)機制尚不清楚。相關(guān)遺傳學(xué)異常主要包括染色體的缺失和重排、異倍體、基因突變及乙型肝炎病毒DNA整合，而表觀遺傳學(xué)改變主要為DNA的異常甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)等[24]。目前肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)超過20種基因表達異常，且?guī)缀跛懈伟┘毎l(fā)生多種基因和遺傳位點的結(jié)構(gòu)性改變，而每種特定遺傳學(xué)或位點改變的影響不超過其中的半數(shù)[25]。這可能由于同時存在幾種不同的致癌機制造成，而不同的致癌機制在不同危險因素下發(fā)揮作用。

發(fā)生肝細胞肝癌的主要危險因素包括病毒(乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)、中毒(酒精和黃曲霉素)、代謝性疾病(糖尿病、血色素沉著癥、非酒精性脂肪性肝病)和免疫相關(guān)(自身免疫性肝炎和原發(fā)性膽管硬化癥)。而其中大多數(shù)危險因素可導(dǎo)致肝硬化的形成和演化。80%～90%的肝細胞肝癌患者合并肝硬化，肝硬化患者的5年累積肝細胞肝癌發(fā)生率為5%～30%[26]。在一些發(fā)達國家肝硬化相關(guān)的肝細胞肝癌病死率上升，而肝硬化非肝細胞肝癌并發(fā)癥的死亡率在不斷下降或穩(wěn)定。隊列研究表明，肝細胞肝癌是失代償肝硬化肝臟相關(guān)死亡的主要病因[26]。

有研究表明，肝臟硬度與乙型和丙型病毒肝炎、非酒精性脂肪肝、肝硬化和肝細胞癌的肝纖維化程度有關(guān)[27]。2003年Sandrin等[28]首次引入基于超聲的瞬時彈性成像技術(shù)，目前其在臨床廣泛應(yīng)用于測量肝臟硬度。它以非侵入性方式對肝纖維化和肝硬化顯示出良好的診斷性能。瞬時彈性成像技術(shù)對多期肝纖維化肝臟硬度的測量范圍為12.5～75.5 kPa，其中F2期的截尾值為7.1 kPa，F(xiàn)3期和F4期的截尾止值分別為9.5 kPa、12.5 kPa(根據(jù)METAVIR評分系統(tǒng))[29]。而應(yīng)用原子力顯微鏡測量局部肝臟組織的硬度。在生理條件下，正常肝組織的硬度約為150 Pa，在纖維化肝中纖維膠原沉積的區(qū)域硬度增加到1～6 kPa[30]。

對于肝臟硬度產(chǎn)生的原因至今尚不清楚。通過用EVG(Elastica van Gieson)染色彈性蛋白顯示，肝內(nèi)彈性蛋白區(qū)域與肝臟硬度呈正相關(guān)，提示彈性蛋白含量可能與肝臟硬度有關(guān)[31]。此外，細胞外基質(zhì)交聯(lián)也可增加組織硬度，特別是賴氨酰氧化酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是細胞外基質(zhì)交聯(lián)過程中起重要作用的兩大類酶。

肝臟硬度的增加使得肝細胞感受到更多的細胞外來力，并通過細胞表面的黏附因子將胞外信號向胞內(nèi)傳導(dǎo)。Schrader等[32]在經(jīng)“基質(zhì)”包被的不同硬度的聚丙烯酰胺凝膠上觀察Huh7和HepG2肝細胞癌細胞發(fā)現(xiàn)，提高基質(zhì)硬度可促進肝癌細胞增殖，并證實其通過β1整合素和黏著斑激酶發(fā)揮作用。Lozoya等[33]用6種不同的水凝膠配方培養(yǎng)人肝臟干細胞，然后使用各種標(biāo)志物分析分化程度。結(jié)果顯示，這些細胞具有硬度依賴行為，表明在理想的機械環(huán)境中播種的細胞能夠以干細胞生態(tài)位中觀察到的相同方式進行自我組織。Yes相關(guān)蛋白(yes-associated protein,YAP)和PDZ結(jié)合域轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcroptional coactivator with a PDZ-binding domain，TAZ)是激活機械敏感通路之一。經(jīng)Dupont等[34]鑒定，轉(zhuǎn)錄輔助因子YAP和TAZ 可作為內(nèi)皮細胞和間充質(zhì)基質(zhì)細胞中的強大機械傳感器，根據(jù)基質(zhì)硬度YAP和TAZ從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核。除機械傳感之外，它們還可作為細胞-細胞黏附、細胞-基質(zhì)黏附和細胞骨架信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心節(jié)點[35]。YAP和TAZ由激酶大腫瘤抑制基因(large tumor suppressor gene，LATS)1和LATS2直接調(diào)節(jié)，YAP/TAZ磷酸化導(dǎo)致細胞質(zhì)螯合或降解。但調(diào)節(jié)YAP/TAZ核穿梭的精確機械傳感機制仍在研究中。YAP和TAZ本身缺乏DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其主要通過TEA結(jié)構(gòu)域因子TEAD1～4，以及通過與幾個直接參與纖維化的轉(zhuǎn)錄因子家族(SMADs和β聯(lián)蛋白)的相互作用介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)[36]。在上皮細胞中，YAP和TAZ介導(dǎo)細胞存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，賦予干細胞分化并參與修復(fù)過程，促進間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。近年針對肺、肝、腎以及真皮的成纖維細胞研究發(fā)現(xiàn)，YAP和TAZ在激活這些細胞向促纖維化轉(zhuǎn)化中起保守和關(guān)鍵作用[37-42]。以上研究表明YAP和TAZ在纖維化級聯(lián)中的核心作用。由于YAP和TAZ在許多器官和組織環(huán)境中廣泛表達和具有重要生理作用，所以這對該途徑的阻斷性靶向治療的合理性及安全性提出挑戰(zhàn)。此外，Rho/Rho激酶信號可能是機械和受體介導(dǎo)的YAP和TAZ激活的關(guān)鍵上游調(diào)節(jié)因子[43]。ROCK抑制劑在臨床前纖維化模型中的陽性結(jié)果表明，YAP/TAZ激活至少部分受到了抑制[44]。而對YAP /TAZ遺傳和分子靶標(biāo)進行的選擇性抑制劑的探索將提供新的治療途徑，進一步阻斷纖維細胞活化的機械受體轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中，YAP和TAZ抑制靶點的選擇是實現(xiàn)治療價值至關(guān)重要的步驟。

4 小 結(jié)

機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)包括硬度反應(yīng)途徑在調(diào)節(jié)基本細胞功能中起重要作用。機械力的重要功能之一是重構(gòu)細胞形態(tài)。細胞反復(fù)感知周圍微環(huán)境的變化，通過許多機械力敏感過程聯(lián)合細胞狀態(tài)實現(xiàn)細胞的極性分化。事實上，形態(tài)是由微環(huán)境決定的，是通過激素、內(nèi)部時鐘和受體酪氨酸激酶的響應(yīng)來實現(xiàn)。而實驗性條件(基質(zhì)的構(gòu)成和硬度)的可控性及可操作性，為今后的研究奠定了重要基礎(chǔ)。最近定義的剛性(硬度)傳感過程，為深入研究細胞如何反復(fù)感知其微環(huán)境變化與癌細胞轉(zhuǎn)化提供了良好示例。另一方面，CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術(shù)進步也促進了在體方法的發(fā)展。條件性敲除和在各種模式生物體中引用突變體能快速了解細胞-細胞外基質(zhì)機械性質(zhì)變化的相關(guān)性及在健康和疾病中的感知方式。 到目前為止，學(xué)者已在果蠅模式生物體中發(fā)現(xiàn)了很大一部分機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)中的相關(guān)性[45-46]。雖然簡單的模式生物在揭示體內(nèi)相關(guān)性方面非常有用，但CRISPR技術(shù)的進步可促進哺乳動物的體內(nèi)研究。目前只有少數(shù)研究開始闡明這些機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，但隨著遺傳和生物物理工具的不斷成熟，其將為如何將機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑整合到生理和病理生理細胞和組織過程提供新方向。