段家名，周 梅，李超英

（江漢大學(xué) 武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北 武漢 430056）

甲基苯丙胺（methamphetamine，MA）是一種人工合成的中樞神經(jīng)興奮劑，自20世紀(jì)90年代以來，甲基苯丙胺成為世界上流行最快、濫用最為廣泛、危害最為巨大的新型毒品[1-3]。長期濫用會(huì)產(chǎn)生高度成癮性，損傷腦的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響認(rèn)知功能[4]。認(rèn)知損傷具體表現(xiàn)在學(xué)習(xí)記憶損傷、注意力渙散等方面[5]，其中學(xué)習(xí)記憶損傷最為突出[6]。許多成癮理論認(rèn)為，學(xué)習(xí)記憶損傷導(dǎo)致的抑制力或執(zhí)行力缺失是成癮的標(biāo)志性特征，會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的藥物濫用行為且使成癮難以治療[7-9]。因此改善甲基苯丙胺導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶損傷對(duì)治療甲基苯丙胺成癮者具有重大意義。

戒毒一號(hào)是本實(shí)驗(yàn)室從大量中藥中篩選的有效復(fù)方，由中藥延胡索等8味中藥提取而成，又經(jīng)過了一系列的質(zhì)量控制和安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)，保證了戒毒一號(hào)的穩(wěn)定性和安全性。

本次實(shí)驗(yàn)研究戒毒一號(hào)對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的影響。通過建立甲基苯丙胺記憶損傷動(dòng)物模型，給予戒毒一號(hào)，用Morris水迷宮檢測動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力，研究戒毒一號(hào)對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷是否具有改善作用，為該藥應(yīng)用于改善甲基苯丙胺所誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 動(dòng)物

本研究使用C57BL/6雄性小鼠，8～10周年齡，體重（22±2）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0011）。小鼠飼養(yǎng)在溫度（23±2）℃、濕度（50±5）%、12-h光/黑暗循環(huán)的環(huán)境中，食物和水充分供應(yīng)。所有關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作均符合江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)要求。

1.2 藥物

戒毒一號(hào)總重94 g（各組分中藥購買自湖北天濟(jì)中藥飲片公司），用1 400 mL水煎煮中藥至400 mL，濃縮成所需濃度的浸膏，用ddH2O配成低、高劑量組（14.12、56.48 kg/mL），灌胃給藥（0.1 kg/mL）。戒毒一號(hào)是本實(shí)驗(yàn)研究的臨床效驗(yàn)方，由延胡索、黨參、西洋參、甘草、茯苓、白術(shù)、黃芪、當(dāng)歸8味中藥組成，各單位藥對(duì)應(yīng)劑量分別為10 g、15 g、3 g、10 g……。

1.3 建立甲基苯丙胺記憶損傷模型

腹腔注射（ip）甲基苯丙胺，10 mg/kg/次/d，連續(xù)注射7 d，建立甲基苯丙胺誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶損傷模型[10]，如圖1所示。造模成功后，從中隨機(jī)選出12只作為低劑量組、12只作為高劑量組（灌胃給藥）。從Mor?ris水迷宮預(yù)適應(yīng)階段開始給藥，低劑量組灌胃（ig）14.12 g/kg戒毒一號(hào)，高劑量組灌胃56.48 g/kg戒毒一號(hào)，其他兩組給予等量的生理鹽水，見表1。

圖1 整體實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 Overall flow chart for experiment

表1 動(dòng)物分組及給藥方式Table.1 Animal grouping and administration methods

1.4 用Morris水迷宮檢測小鼠空間學(xué)習(xí)記憶

Morris水迷宮（上海欣軟信息科技有限公司，XR-XM101）主要由一個(gè)游泳池、一個(gè)攝像機(jī)和一個(gè)分析系統(tǒng)組成。將直徑120 cm、高50 cm的水迷宮圓形水槽注滿水，水深約為21 cm，保持水溫（23±2）℃，倒入二氧化鈦（一種食品添加劑，安全、無毒）混勻使其背景為白色。將一直徑為6 cm的平臺(tái)置于水迷宮東北象限（即目標(biāo)象限），平臺(tái)表面低于水面1.5 cm。水迷宮實(shí)驗(yàn)主要分為三階段：預(yù)適應(yīng)階段、訓(xùn)練階段和測試階段。記錄小鼠的游泳軌跡，通過逃避潛伏期和穿梭平臺(tái)的次數(shù)來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力。

水迷宮前兩天為預(yù)適應(yīng)階段：將每只小鼠從相同的位置放入水中，使其在水迷宮中自由游泳1 min。進(jìn)行該階段的目的為消除小鼠對(duì)水的恐懼，使小鼠適應(yīng)環(huán)境，避免環(huán)境因素帶來的實(shí)驗(yàn)誤差。

水迷宮訓(xùn)練階段：在這個(gè)階段平臺(tái)固定在東北象限正中間，置于水下1.5 cm。每次訓(xùn)練小鼠要從不同的位置進(jìn)入水迷宮，每只小鼠同一個(gè)位置每天只訓(xùn)練一次，并且每天訓(xùn)練的起始位置不同（見表2）。

表2 Morris水迷宮訓(xùn)練階段每次的起始位置Tab.2 Spatial start positions of each time in Morris water maze

記錄小鼠游泳軌跡，小鼠從進(jìn)入水中到找到水下平臺(tái)的時(shí)間（s）為逃避潛伏期。每次訓(xùn)練間隔為15～20 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d。如果小鼠在60 s未找到水下平臺(tái)，則引導(dǎo)小鼠游到平臺(tái)，使其停留10 s。訓(xùn)練完畢后將小鼠身體擦干，置于白熾燈下烘干身體后放回籠內(nèi)。將小鼠的游泳速度作為評(píng)價(jià)小鼠運(yùn)動(dòng)能力的指標(biāo)，將逃避潛伏期作為小鼠空間學(xué)習(xí)能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

水迷宮測試階段：第6天撤除原平臺(tái)，將所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從相同的入水點(diǎn)放入水中，記錄小鼠在1 min內(nèi)穿梭原平臺(tái)的次數(shù)和穿梭目標(biāo)象限的時(shí)間，以此作為小鼠空間記憶能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以mean±SEM表示，小鼠的游泳速度和訓(xùn)練階段的逃避潛伏期采用重復(fù)測量方差分析，檢測階段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 小鼠的游泳速度

檢測各組小鼠在整個(gè)水迷宮階段的游泳速度，游泳速度的差異性能夠反映出甲基苯丙胺和戒毒一號(hào)對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，盡管在第一天有輕微的影響，整體來看，模型組和給予戒毒一號(hào)組差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖2）。結(jié)果表明給予甲基苯丙胺和戒毒一號(hào)并不影響小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，因此排除了運(yùn)動(dòng)能力對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力改變的干擾。

圖2 小鼠在學(xué)習(xí)階段和記憶檢測階段的游泳速度Fig.2 Swimming speed of mice in both learning and memory testing phases

2.2 戒毒一號(hào)對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)損傷的影響

與對(duì)照組相比，模型組的逃避潛伏期明顯比對(duì)照組長，且在第4天和第5天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明模型組出現(xiàn)了學(xué)習(xí)能力損傷，造模成功；與模型組相比，低劑量組的逃避潛伏期明顯縮短，且在第4天和第5天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明戒毒一號(hào)低劑量改善了甲基苯丙胺誘導(dǎo)的小鼠的學(xué)習(xí)損傷；高劑量組與模型組相比，逃避潛伏期有縮短的趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

訓(xùn)練階段的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：戒毒一號(hào)能夠改善甲基苯丙胺誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)損傷。

圖3 訓(xùn)練階段的逃避潛伏期Fig.3 Escape latency during learning phase

2.3 戒毒一號(hào)對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)小鼠記憶損傷的影響

統(tǒng)計(jì)檢測階段小鼠穿梭平臺(tái)的次數(shù)結(jié)果見圖4。與對(duì)照組相比，模型組在單位時(shí)間內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著下降（P＜0.05），表明模型組的空間記憶能力受損；與模型組相比，低劑量組在單位時(shí)間內(nèi)穿梭平臺(tái)的次數(shù)顯著提高（P＜0.05），表明戒毒一號(hào)低劑量組的空間記憶能力得到了改善；高劑量組與模型組相比，高劑量組在單位時(shí)間內(nèi)穿梭平臺(tái)的次數(shù)與模型組相比有增加的趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明高劑量具有改善小鼠的空間記憶能力的趨勢。從檢測階段小鼠穿梭目標(biāo)象限的時(shí)間來看（見圖5），模型組穿梭目標(biāo)象限的時(shí)間與對(duì)照組相比顯著縮短（P＜0.05）；低劑量組與模型組相比顯著延長（P＜0.05）；高劑量組與模型組相比，穿梭目標(biāo)象限的時(shí)間也有增加的趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明了低劑量的戒毒一號(hào)改善了小鼠的空間記憶能力，而高劑量在一定程度上也具有能改善小鼠的空間記憶能力的趨勢。圖6為檢測階段各組小鼠代表性運(yùn)動(dòng)軌跡。

綜合檢測階段的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，戒毒一號(hào)能夠改善甲基苯丙胺誘導(dǎo)的記憶能力損傷。

圖4 檢測階段穿梭平臺(tái)的次數(shù)Fig.4 Times of platform crossing in testing phase

圖5 檢測階段穿梭目標(biāo)象限的時(shí)間Fig.5 Time of objective quadrant crossing in testing phase

圖6 水迷宮檢測階段具有代表性的小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡Fig.6 Representative motion trajectory of mice in water maze test

3 討論

Morris水迷宮是醫(yī)學(xué)上用于檢測動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶能力的經(jīng)典方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，戒毒一號(hào)（14.12 g/kg）能夠顯著減少甲基苯丙胺誘導(dǎo)小鼠的逃避潛伏期，表明其具有良好的改善空間學(xué)習(xí)能力；能夠使甲基苯丙胺誘導(dǎo)的小鼠在單位時(shí)間內(nèi)穿梭平臺(tái)的次數(shù)增加和穿梭目標(biāo)象限的時(shí)間增加，這表明其具有改善空間記憶能力?？傮w實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明戒毒一號(hào)改善了甲基苯丙胺誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷。

戒毒一號(hào)是由延胡索、當(dāng)歸、西洋參等中藥制成的復(fù)方。其中主要成分延胡索乙素（l-THP）是從罌粟科（papaveraceae）紫堇屬（CorydalisDC.）植物延胡索（Corydalis yanhusuoW.T.Wang）的干燥塊莖中提取出來的[11]。研究表明延胡索及其有效成分延胡索乙素是一種新型的多巴胺受體（DA）抑制劑，并且長時(shí)間服用沒有成癮性[12-13]。龔曉康等[14]的研究表明l-THP能夠拮抗甲基苯丙胺對(duì)中樞神經(jīng)的刺激作用和毒理作用，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

EGAN等[15]研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的中腦-邊緣系統(tǒng)的DA系統(tǒng)在認(rèn)知學(xué)習(xí)過程中起著關(guān)鍵性作用，D1和D2受體都參與了記憶的調(diào)控過程，并且腦內(nèi)DA的缺乏和過量與認(rèn)知功能有著密切的關(guān)系。因此這在一定的程度上解釋了戒毒一號(hào)可能是通過抑制多巴胺釋放，通過多巴胺系統(tǒng)改善了小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。戒毒一號(hào)中其他配伍藥物當(dāng)歸、茯苓和西洋參的不同成分都在一定程度上具有改善學(xué)習(xí)能力的作用。王虎平等[16]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖可能通過改善膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)、提高抗自由基氧化能力及促進(jìn)β-淀粉樣蛋白的代謝，改善老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；張敏[17]發(fā)現(xiàn)茯苓多糖能夠改善老年癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力；劉凱等[18]研究發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)給予西洋參莖葉中的人參皂苷對(duì)動(dòng)物受損傷的學(xué)習(xí)記憶功能有改善作用。因此，戒毒一號(hào)是以延胡索為主，其他藥物為輔，協(xié)同改善了甲基苯丙胺誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明戒毒一號(hào)具有改善甲基苯丙胺誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷作用，其主要機(jī)制可能與其抑制多巴胺通路而改善了學(xué)習(xí)記憶能力。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)從行為學(xué)上檢驗(yàn)了戒毒一號(hào)對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶損傷的作用，后續(xù)還可以繼續(xù)研究與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的分子機(jī)制。