曹 旭，張武劍，李 桃

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院群力院區(qū)麻醉科，哈爾濱 150001)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)，其發(fā)病率和病死率逐年升高[1]，雖然目前認為其發(fā)病是由于基因易感性及環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的腸黏膜異常炎癥應(yīng)答，但具體機制仍不清楚。IBD是一類病因不明、反復(fù)發(fā)作的慢性腸道疾病[2]。IBD存在高凝狀態(tài)和增加的血栓栓塞事件[3]。血細胞和微粒是血液中主要受炎癥影響的原始成分，其中巨噬細胞主要通過釋放細胞因子和化學介質(zhì)在IBD中發(fā)揮促凝作用。IBD患者內(nèi)皮功能障礙的機制是腸道局部炎性物質(zhì)能夠損傷微血管內(nèi)皮細胞，直接和間接激活血小板，從而促進血栓形成。既往文獻多以研究IBD與血小板凝血物質(zhì)及凝血功能變化的相關(guān)性為主，研究方向較局限。臨床中中性粒細胞在IBD中的作用有爭議，一方面介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[4]，一方面參與組織修復(fù)[5]，因此全面了解中性粒細胞在IBD中的作用及機制尤為重要?，F(xiàn)主要對中性粒細胞、中性粒細胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)和促凝作用明確的微粒在IBD并發(fā)血栓栓塞事件中的機制進行全面概述，從而為IBD血栓事件的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 中性粒細胞在IBD的作用

中性粒細胞灌注是感染性結(jié)腸炎和IBD等急性腸炎的重要標志，腸上皮細胞有分泌趨化炎性因子和誘導(dǎo)中性粒細胞跨上皮遷移的潛能。在IBD活動期，大量中性粒細胞和淋巴細胞灌注到腸黏膜，其中中性粒細胞在IBD炎癥進展中發(fā)揮不可或缺的作用。一旦中性粒細胞浸潤到腸黏膜就會通過釋放活性氧類、一氧化氮、溶酶體酶、花生四烯酸代謝物和細胞因子等物質(zhì)發(fā)揮細胞毒性作用，此外，中性粒細胞還能釋放NETs殺滅病原體。這些作用對于機體成功地防御腸外病原體和炎癥的適當緩解起重要作用。但是這個過程沒有被嚴謹有序地控制好時，中性粒細胞就會被過度激活，成為IBD中重要的促炎、促凝因素。

1.1中性粒細胞主要通過表達組織因子促進血栓的形成 中性粒細胞促進血栓形成的能力在IBD血栓形成中也有重要作用。事實上，中性粒細胞已被證明在小鼠深靜脈血栓形成模型中必不可少[6]。此外，在小鼠的小動脈，它們首先被招募到激活的內(nèi)皮細胞周圍，從而促進血小板活化和纖維蛋白生成[7]。Maugeri等[8]研究表明，中性粒細胞激活后表達組織因子。在小鼠模型中，在提睪肌小動脈激光損傷部位的中性粒細胞表達組織因子，并且黏附在內(nèi)皮表面引起血栓形成[7]。同時，中性粒細胞源性的微粒也表達組織因子。在硫酸葡聚糖處理后的UC小鼠模型中，提睪肌小動脈血栓形成增強和血漿凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物水平升高，抑制組織因子后所有這些指標明顯降低[9]。抑制組織因子也能減少沿結(jié)腸靜脈黏附的血小板、白細胞的數(shù)量和組織損傷，表明組織因子參與腸道炎癥的發(fā)病機制和相關(guān)的血栓性事件[10]。此外，中性粒細胞還可產(chǎn)生中性粒細胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶G兩種促凝酶。這些酶能損傷內(nèi)皮細胞激活血小板，促進血栓的形成。在三氯化鐵誘導(dǎo)的血管損傷中，這些酶還能水解組織因子途徑抑制物使其失活，從而導(dǎo)致抗凝系統(tǒng)功能減弱[10]。組織因子的增高促進凝血瀑布級聯(lián)激活和凝血酶生成，凝血酶生成同時也能進一步激活血小板。所有這些過程均增加了IBD患者的血栓形成風險。

1.2IBD患者的中性粒細胞釋放細胞外誘捕網(wǎng) NETs釋放是中性粒細胞的一種新的死亡方式，也是中性粒細胞增加病原體殺傷及炎癥反應(yīng)的新方式。中性粒細胞在多種病原體和佛波酯等物質(zhì)刺激下，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，激活中性粒細胞彈性蛋白酶和肽精氨酸脫亞胺酶4，促使染色質(zhì)去致密化，顆粒膜和核膜破裂，釋放以染色質(zhì)為骨架結(jié)合多種顆粒酶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)到細胞外[11]。自2004年NETs發(fā)現(xiàn)以來，其各方面的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。NETs既在病原菌防御中發(fā)揮重要作用，也能對宿主引起毒性反應(yīng)。實際上，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NETs可以參與急性胰腺炎、肺炎、肝臟缺血再灌注損傷等多種器官和組織損傷過程，這些過程可能與組蛋白、蛋白酶、活性氧等多種物質(zhì)有關(guān)[12]。探究NETs對腸組織的損傷作用有利于進一步揭示中性粒細胞在IBD發(fā)生、發(fā)展中的作用機制。炎癥是IBD疾病發(fā)生和發(fā)展的主要表現(xiàn)，NETs是一種連接先天免疫和炎癥之間新的識別方式，有研究表明NETs在UC通過呈遞白細胞介素1β介導(dǎo)活動時期的腸損傷，通過攜帶組織因子促凝，而在CD的腸組織中無NETs的存在[13]。體外研究表明，NETs破壞培養(yǎng)的人腸上皮樣細胞Caco-2/TC7細胞的F-肌動蛋白細胞骨架[14]，然而在IBD動物模型中，NETs對分離的腸上皮細胞和體內(nèi)腸上皮的損傷作用以及具體機制并不十分清楚。此外，NETs也能與巨噬細胞、T細胞等相互作用，刺激其釋放炎性因子等介質(zhì)加重炎癥反應(yīng)。

1.3中性粒細胞釋放細胞外誘捕網(wǎng)促進IBD的血栓形成 NETs是以染色質(zhì)纖維為平臺，網(wǎng)絡(luò)顆粒蛋白如中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、髓過氧化物酶或高遷移率族蛋白B1，這些成分負責NETs的促炎癥促凝血性能。NETs雖然能誘捕病原體和防止其傳播使暴露于高濃度的抗微生物因子，但也能夠誘導(dǎo)血小板黏附、活化和聚集，促進血栓形成。NETs參與血栓形成，通常是由配體結(jié)合中性粒細胞Toll樣受體2和4或IgG復(fù)合物的受體[15]。體外研究表明NETs可以通過血小板依賴和非依賴方式參與凝血系統(tǒng)的激活，還能網(wǎng)絡(luò)并激活血小板、紅細胞等，為血栓形成提供平臺和支架；體內(nèi)實驗表明NETs參與動物多種實驗性血栓模型和人靜脈血栓等的形成[16-17]。此外，NETs形成的標志物與人冠狀動脈粥樣硬化嚴重性相關(guān)并為促栓狀態(tài)提供證據(jù)。NETs也參與體內(nèi)靜脈和動脈血栓形成過程。

2011年有研究發(fā)現(xiàn)IBD患者腸組織中可能存在NETs[18]，2015年IBD雜志發(fā)表的一篇研究表明，通過蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)在UC患者組織標本中有11種與中性粒細胞以及NETs有關(guān)的蛋白質(zhì)升高，包括髓過氧化物酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶9和組織蛋白酶G[19]。這些數(shù)據(jù)已通過顯微鏡觀察到得以驗證，并顯示在成人UC患者而不在CD患者的腸組織中存在[13]，而在兒科的UC和CD患者小腸和結(jié)腸組織中均有大量NETs[20]。CD的危險因素(抗生素相關(guān)的腸道菌群失調(diào)、腸微生物)在動物模型中能刺激更多的NETs釋放[21]。He等[22]也提出NETs是IBD高凝狀態(tài)的原因，IBD患者中性粒細胞在體外刺激后，相比于對照組能釋放更多的NETs。在同一項研究中，活動性疾病患者血清處理中性粒細胞，NETs釋放率升高。表明這些IBD患者擁有能夠誘導(dǎo)NETs生成的血清微環(huán)境。這可能是由于患者血清中的抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體能夠刺激中性粒細胞釋放NETs?？怪行粤＜毎|(zhì)抗體實際上是針對NETs成分，如髓過氧化物酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G或蛋白酶3的抗體。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體可能會引發(fā)NETs釋放，通過暴露中性粒細胞抗原參與抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體產(chǎn)生的放大反應(yīng)。NETs除具有促進血栓形成的表型外，也有助于小血管炎[23]和纖溶亢進[24]，引起IBD腸道組織損傷和隨后的出血。因此，NETs可能還在胃腸道出血中發(fā)揮重要作用。

基于以上研究推斷，NETs可能參與IBD組織損傷、炎癥進展和高凝狀態(tài)等過程，進一步探究NETs參與IBD的機制有助于深入發(fā)掘先天性免疫在IBD中發(fā)揮的作用，為IBD的治療提供新方向。

2 微粒在IBD中的作用

當血管內(nèi)的細胞(包括血液細胞及內(nèi)皮細胞)被激活、損傷后或發(fā)生凋亡時，就會有直徑為0.1～1.0 μm的微囊泡從細胞膜脫落，這些釋放入血的小囊泡稱為微粒。微粒攜帶該微粒來源細胞的部分蛋白，所以具有相應(yīng)母細胞的表型和功能。微粒既能發(fā)揮一定的生理和病理功能，又能作為一種標志物，反映細胞的激活和疾病的進展狀態(tài)，它的一些生物學活性與疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。目前，微粒主要功能有促凝、促炎、調(diào)節(jié)免疫等，此外它還能作用于內(nèi)皮細胞，誘導(dǎo)血管生長、調(diào)節(jié)血管收縮。循環(huán)微粒水平在各種心血管疾病、慢性炎癥性疾病中升高，并發(fā)揮一定的作用。微粒也是IBD中重要的促炎、促栓因素。對于它的認識還在不斷的探索，其研究也越來越多。微粒的研究對進一步認識炎癥性疾病IBD的發(fā)生、發(fā)展和血栓栓塞性并發(fā)癥的防治具有重要臨床意義。

2.1IBD患者微粒水平增高 2005年Chamouard等[25]首次發(fā)現(xiàn)CD患者總的循環(huán)微粒升高，而且釋放的微粒與CD相關(guān)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，治療疾病的特效藥英夫利昔單抗也能顯著降低微粒水平。根據(jù)微粒的來源將微粒分為血小板微粒、粒細胞微粒、紅細胞微粒、內(nèi)皮微粒及淋巴細胞微粒等。血小板微粒和內(nèi)皮細胞微粒占循環(huán)微粒的主要部分，所以其研究較多，但白細胞微粒在炎癥方面的作用也逐漸被廣泛認識到。與健康人相比，活動CD患者總循環(huán)微粒、血小板微粒、粒細胞微粒、內(nèi)皮微粒均增加，總的微粒在活動性患者中比非活動性明顯增高，而且與炎癥的活動性指標紅細胞沉降率、C反應(yīng)蛋白相關(guān)。

2.2微粒在介導(dǎo)IBD炎癥中的作用 在IBD中，體內(nèi)分離和體外誘導(dǎo)血小板產(chǎn)生的血小板微粒能夠提高腸道環(huán)加氧酶2的表達，增加活性氧類的產(chǎn)生，從而加重炎癥反應(yīng)[26]。Andoh等[27]發(fā)現(xiàn)，循環(huán)血小板微粒水平與IBD臨床活動性和血小板聚集活性相關(guān)。這些結(jié)果表明，血小板微粒是IBD患者血小板活化狀態(tài)有用的標志物。同時，活動期IBD高水平循環(huán)血小板微粒表明，血小板在IBD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮細胞微粒是第二大循環(huán)微粒。它主要通過內(nèi)皮細胞的活化或凋亡產(chǎn)生。在IBD中，內(nèi)皮細胞微粒能夠增加血液的高凝狀態(tài)，促進腸道炎癥反應(yīng)，還能調(diào)節(jié)血管張力，這與內(nèi)皮細胞微粒表面表達的相關(guān)活性分子有關(guān)[28]。Leonetti等[29]將從CD患者外周血提取的微粒注射到正常的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠主動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張和腸系膜小動脈血流誘導(dǎo)的擴張功能受到損傷。一氧化氮合酶抑制劑能逆轉(zhuǎn)這種損傷，這與一氧化氮、活性氧類和環(huán)加氧酶代謝產(chǎn)物釋放之間平衡的微妙改變有關(guān)。說明CD患者的微粒能大大改變內(nèi)皮和血管功能，因此微?？赡茉贑D的發(fā)病機制中發(fā)揮作用，至少部分導(dǎo)致不可控制的血管炎癥相關(guān)的腸道損傷。

2.3微粒促進IBD高凝狀態(tài) 微粒通過帶負電荷的磷脂表面和促凝蛋白如組織因子暴露促血栓形成。新的證據(jù)表明，血細胞微?？赡軐?dǎo)致IBD的血栓前狀態(tài)[29]。暴露于血液中的組織因子是外源性凝血途徑的始動因素，是主要的啟動凝血因子。組織因子作為外源性凝血途徑的啟動者，在IBD患者腸黏膜損傷后，內(nèi)皮下組織因子暴露增多[30]。而腸外血栓形成的組織因子來源于循環(huán)血細胞表面表達和微粒釋放。在對組織因子陽性微粒研究中，IBD患者較對照組增高，雖然Palkovits等[31]得出組織因子陽性微粒與患者高凝狀態(tài)(D-二聚體水平)不相關(guān)。但大部分研究表明，來自腸道血管內(nèi)帶有組織因子的微粒進入全身循環(huán)是炎癥導(dǎo)致血栓形成的發(fā)病機制之一[27-30]。而He等[22]用敏感的磷脂酰絲氨酸探針乳黏素，證明活動性IBD的總磷脂酰絲氨酸陽性微粒和血小板微粒明顯增高，并且微粒表面暴露的磷脂酰絲氨酸在IBD高凝狀態(tài)及血栓形成中發(fā)揮主要作用。在兒科胃腸病研究中，Deutschmann等[32]研究表明微粒的促凝活性在活動性、靜止性CD和活動性UC患者中顯著增高，來源于IBD兒童患者微粒的凝血酶生成能力明顯增高，它可能是通過微粒表面表達組織因子或循環(huán)血細胞傳遞組織因子到血栓部位引發(fā)腸外血栓形成的[33]。

凋亡的細胞及活化的血小板均產(chǎn)生微粒，在急性冠狀動脈綜合征中，Mallat和Tedgui[34]利用膜連蛋白Ⅴ與微粒表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合的特性分析急性冠狀動脈綜合征外周血中微粒升高的意義，表明外周血中微粒水平增高有利于預(yù)測血栓形成及心肌缺血。提示微粒也能預(yù)測IBD患者血栓及腸潰瘍形成。

3 結(jié) 語

IBD患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的最可能原因是IBD疾病本身相關(guān)的炎癥，而這種高凝狀態(tài)和血栓動態(tài)反過來參與慢性腸道炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程。通過靶向降低血小板和白細胞數(shù)量和微粒水平，抑制NETs的生成，能進一步預(yù)防和治療IBD血栓栓塞的發(fā)生。闡明IBD中高凝狀態(tài)的機制不僅有利于防治血栓并發(fā)癥的發(fā)生，也有利于控制疾病炎癥狀態(tài)和進一步發(fā)展。認識到炎癥和凝血之間在IBD中的聯(lián)系，有助于深入發(fā)掘凝血系統(tǒng)在IBD中發(fā)揮的作用，為IBD的治療提供新方向，靶向減少炎癥-凝血的相互作用，有利于降低IBD患者發(fā)病率和病死率。