劉德鴻 ,文帥龍,龔琬晴,鐘繼承*,鐘文輝
1. 南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023;2. 湖泊與環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所,江蘇 南京 210008;3. 洛陽市共生微生物與綠色發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,河南 洛陽 471023
隨著人類社會的快速發(fā)展,大量氮素進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng),打破了原有生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)的平衡,導(dǎo)致一系列環(huán)境問題的發(fā)生。湖泊生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,其重要性不容忽視,尤其是近年來,湖泊富營養(yǎng)化程度的加劇,已成為氧化亞氮(N2O)排放研究的新熱點(diǎn)(Yao et al.,2016)。而反硝化作用作為生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)中重要的組成部分,早在上個(gè)世紀(jì) 70年代已受到研究者的廣泛關(guān)注(Koike et al.,1978)。
反硝化過程產(chǎn)生的N2O逐年增多(Bouwman et al.,2013),加劇溫室效應(yīng),有關(guān)反硝化的機(jī)制、影響因素以及N2O排放及機(jī)制等研究,在農(nóng)田(李飛躍等,2012)、森林(Groffman et al.,1989)、海洋(Singh et al.,2010)、濕地(Burgin et al.,2015)、湖泊(Myrstener et al.,2016)等生態(tài)系統(tǒng)中被廣泛開展。反硝化作用主要由反硝化微生物驅(qū)動(dòng)完成,依次經(jīng)過硝酸還原酶、亞硝酸還原酶,一氧化氮還原酶以及氧化亞氮還原酶催化,最終被還原為N2,對應(yīng)基因編碼分別為:narG或napA,nirS或nirK,norB及nosZ。反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)及功能與外界環(huán)境因子密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn),氮素含量和pH對反硝化細(xì)菌豐度有顯著影響(鮑林林等,2016),沉積物有機(jī)質(zhì)與nirS豐度呈正相關(guān)(Hou et al.,2013),反硝化細(xì)菌豐度存在明顯的季節(jié)變化(Lisa et al.,2014),添加生物炭的土壤N2O排放與nosZ關(guān)系密切(Cayuela et al.,2013),N2O排放量隨施用硝態(tài)氮量增加而顯著增加,但與反硝化基因豐度之間并沒有顯著相關(guān)性(鄭燕等,2012)。因此,反硝化功能微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度及其對環(huán)境因子的響應(yīng)與N2O排放的關(guān)系,由于生態(tài)環(huán)境的不同而存在較大差異。為此,本研究選取太湖不同生態(tài)類型湖區(qū)沉積物為研究對象,分析了不同季節(jié)沉積物化學(xué)性質(zhì)、N2O通量以及反硝化功能基因豐度,并探討了它們之間的關(guān)系,旨在探明太湖沉積物反硝化功能基因豐度的季節(jié)變化,及其與環(huán)境因子的關(guān)系,初步揭示影響太湖沉積物N2O排放的微生物學(xué)機(jī)理,為進(jìn)一步深入研究太湖沉積物N2O排放機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。
圖1 太湖采樣點(diǎn)位分布圖Fig.1 Distribution of sampling sites in Taihu Lake
太湖是中國第三大淡水湖,地處亞熱帶,氣候溫和濕潤,屬季風(fēng)氣候,湖水面積2338 km2,平均水深 1.9 m,是典型的大型淺水型湖泊,其位于經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的長三角地區(qū),水體具有供水、漁業(yè)、航運(yùn)、旅游等重要功能,對該區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要作用,受人為活動(dòng)影響很大,過量氮磷的輸入導(dǎo)致水體持續(xù)富營養(yǎng)化(Xu et al.,2016)。太湖有著復(fù)雜的生態(tài)類型,具有草型、藻型及敞水區(qū)。采樣點(diǎn)S1位于梅梁彎為典型的藻型湖區(qū),一年中多數(shù)月份藍(lán)藻占絕對優(yōu)勢,平均水深約3 m,無沉水植物,底部沉積有較多的淤泥,是太湖富營養(yǎng)化最嚴(yán)重的湖區(qū);S2位于中部較開闊區(qū)域,無大型水生植物,仍以藻類居多,底部是有機(jī)質(zhì)含量較少的沙質(zhì)沉積物;S3和S4位于太湖東部區(qū)域,以大型水生植物為主,水環(huán)境質(zhì)量較好(劉新等,2017),其中S3以挺水植物居多,S4以沉水植物為主,沉積物為含較多有機(jī)碎屑的軟泥。具體點(diǎn)位見圖 1,沉積物理化性質(zhì)見表1。
表1 沉積物理化參數(shù)(以干質(zhì)量計(jì))Table1 Physicochemicalproperties of sediment (dry mass)
使用GPS定位,于2014年8月(夏)、2014年11月(秋)、2015年2月(冬)以及2015年5月(春)分別在點(diǎn)位S1、S2、S3和S4用重力采樣器采集沉積物柱樣3根,然后取表層2 cm沉積物放入自封袋,排出空氣以保持厭氧環(huán)境,樣品盡快帶回實(shí)驗(yàn)室,分析沉積物基礎(chǔ)化學(xué)指標(biāo),此外從各樣品袋中取出部分沉積物樣品供DNA提取之用。采樣在每個(gè)月中旬,盡量在天氣晴好、風(fēng)浪較小的情況下進(jìn)行,采樣的同時(shí)使用多參數(shù)水質(zhì)儀(YSI,USA)現(xiàn)場測定水溫等參數(shù)。
沉積物經(jīng)冷凍干燥后過0.15 mm篩,采用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法測定總氮(TN),采用鉬酸鹽分光光度法測定總磷(TP)(魏復(fù)盛,2002),氨氮()采用KCl浸提-蒸餾法測定,硝氮()采用酚二磺酸光度法測定,亞硝氮()采用鹽酸萘乙二胺分光光度法測定,有機(jī)碳(Org-C)采用重鉻酸鉀氧化法測定,磷酸根()采用NaHCO3浸提-鉬酸鹽分光光度法測定(鮑士旦,2002)。沉積物N2O通量的測定可參照文獻(xiàn)(鐘繼承等,2009)。具體操作如下:稱取3 g左右的沉積物樣品于50 mL血清瓶中,加入10 mL事先用高純N2曝氣過的原位湖水,然后再用高純N2吹掃10 s,立即蓋上橡膠塞以維持厭氧環(huán)境。每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)處理,第一組處理為對照,用來采集0時(shí)刻氣體樣品,第二組處理振蕩(70 r·min-1)避光培養(yǎng)4 h,用來測定沉積物N2O的通量,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。采集氣體樣品前,劇烈搖晃血清瓶,以使頂空氣體達(dá)到平衡,然后注射18 mL 3 mol·L-1NaCl溶液于血清瓶中,同時(shí)用另一支注射器收集置換出的氣體,然后注入事先抽真空的氣體樣品瓶中。N2O采用帶電子捕獲器的氣相色譜儀(Agilent 7890B)測定。沉積物N2O通量以單位時(shí)間內(nèi)干質(zhì)量沉積物的N2O生成量計(jì)。
沉積物DNA采用FastDNA SPIN Kit for Soil(MP,Biomedicals,USA)試劑盒提取,參照試劑盒內(nèi)存放的DNA提取操作步驟,進(jìn)行DNA提取和操作。用 SmartSpecTMPlus Spectrophotometer(BIO-RAD,USA)測定DNA的純度及濃度,將提取好的DNA稀釋10倍后保存于-20 ℃冰箱,原樣保存于超低溫冰箱備用。
表2 qPCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)Table2 Amplification primer and reaction programs of qPCR
反硝化功能基因nirK、nirS、norB、nosZ的豐度采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qPCR)測定,采用SYBR green染料法,在CFX96 Real-Time System(BIO-RAD,USA)儀器上運(yùn)行檢測。選取環(huán)境樣品中得到的nirK、nirS、norB、nosZ的重組質(zhì)粒,根據(jù)已知質(zhì)粒濃度和阿伏伽德羅常數(shù)(6.02×1023),配置標(biāo)準(zhǔn)曲線模板,最終得到的擴(kuò)增效率分別為115.2%(R2=99.5%)、86.8%(R2=99.1%)、100.6%(R2=99.5%)、101.7%(R2=99.4%),符合實(shí)驗(yàn)要求。qPCR反應(yīng)采用20 μL體系,包括10 μL 2×SYBR premix Ex TaqTM(TaKaRa Shuzo,Shiga,Japan),20 μmol·L-1上下游引物、2 μL 模板 DNA(6-10 ng)以及7.6 μL滅菌超純水。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)和1個(gè)陰性對照(以滅菌超純水代替DNA作為反應(yīng)模板),其qPCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)程序見表2。
qPCR數(shù)據(jù)采用 CFX ManagerTM軟件進(jìn)行分析,沉積物理化性質(zhì)、沉積物N2O通量與反硝化功能基因豐度的 Pearson相關(guān)性分析采用 SPSS 19.0處理,Origin 8.5制圖。
各樣點(diǎn)沉積物基礎(chǔ)理化指標(biāo)如表1所示。沉積物TN和TP全年變幅較小,其中位于梅梁彎的S1點(diǎn)位是典型的藻型湖區(qū),富營化程度最高,TN明顯高于其他點(diǎn)位,其次是位于草型湖區(qū)的S3和S4;TP是S1點(diǎn)位最高,其次是位于敞水區(qū)的S2,草型湖區(qū)的S3和S4最低。沉積物無機(jī)氮僅占TN含量的0.8%-4.42%。秋季沉積物氨氮含量最高,均值為(42.63±15.46) mg·kg-1,這是由于秋季水生植物和藻類逐漸死亡沉積于沉積物表層,分解礦化釋放出氨,加之利用率低,進(jìn)而導(dǎo)致氨氮升高(朱夢圓等,2011)。硝態(tài)氮是本研究湖區(qū)無機(jī)氮的主要形態(tài),其 夏 季 均 值 為 (20.32±1.98) mg·kg-1, 與 秋 季[(19.67±1.31) mg·kg-1]無明顯差異。冬季硝態(tài)氮含量最高[(24.31±4.29) mg·kg-1],春季最低[(14.22±2.66)mg·kg-1]。亞硝態(tài)氮在沉積物中無積累,均值為(0.21±0.06) mg·kg-1。PO43-含 量 較 低 , 均 值 為(0.41±0.19) mg·kg-1。沉積物有機(jī)碳存在明顯的季節(jié)變化規(guī)律,整體表現(xiàn)為夏秋季節(jié)低、冬春季節(jié)高的趨勢。大型水生植物與藻類相比有更高的生物量,更有利于所在區(qū)域有機(jī)碳的積累,故S3和S4有機(jī)碳含量明顯高于S1和S2。
沉積物N2O通量季節(jié)變化如圖2所示。各樣點(diǎn)沉積物N2O通量季節(jié)變化規(guī)律基本一致,夏秋沉積物 N2O整體表現(xiàn)為負(fù)排放,其通量為-0.12-0.04 nmol·g-1·h-1,均值為-0.05 nmol·g-1·h-1。夏秋季沉積物的厭氧環(huán)境使對厭氧高敏感的Nos基因合成酶的活性顯著增強(qiáng)并超過其他3種,有利于反硝化的徹底進(jìn)行并最終生成N2(Souza et al.,2017),反硝化消耗N2O而導(dǎo)致N2O產(chǎn)生負(fù)排放。冬春季整體表現(xiàn)為排放,通量為-0.05-0.48 nmol·g-1·h-1,均值為 0.27 nmol·g-1·h-1。各樣點(diǎn)沉積物 N2O 通量均在冬季達(dá)到全年最高,冬季沉積物氨氧化細(xì)菌(AOB)豐度高于夏秋季(程建華等,2016),冬季較高的有機(jī)碳含量有利于異養(yǎng)硝化細(xì)菌進(jìn)行異氧硝化而生成N2O,而且AOB的反硝化也能產(chǎn)生N2O(Peng et al.,2015),這都可導(dǎo)致冬季沉積物產(chǎn)生較高的N2O通量。
圖2 沉積物N2O通量季節(jié)變化Fig.2 Seasonal variation of sediment N2O flux
圖3 沉積物反硝化功能基因豐度Fig.3 Denitrification function gene abundance in sediment
沉積物反硝化功能基因豐度季節(jié)變化如圖3所示,各功能基因均大致表現(xiàn)為夏秋季節(jié)高、冬春季節(jié)低的特點(diǎn),各樣點(diǎn)夏秋季節(jié)差異較大,而冬春季節(jié)差異較小,與太湖西部區(qū)域沉積物nirS基因豐度季節(jié)變化(羅躍輝等,2017)規(guī)律相同。從年均值來看,各樣點(diǎn)沉積物中 norB基因豐度最高,為9.03×109copies·g-1,其次為 nirS 基因(1.14×109copies·g-1),nirK 和 nosZ基因豐度均值分別為3.04×108copies·g-1和 1.09×108copies·g-1,S1 和 S2反硝化功能基因豐度整體大于S3和S4。
表3 反硝化功能基因豐度與沉積物化學(xué)性質(zhì)Pearson相關(guān)性Table3 Pearson correlation analysis between denitrification function gene abundance and chemical properties of sediment
環(huán)境因子的變化可影響微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)(Bostr et al.,1989)。沉積物理化性質(zhì)與反硝化功能基因相關(guān)性分析結(jié)果如表 3所示,除 nosZ外,其余各反硝化功能基因均與沉積物含量呈極顯著正相關(guān),沉積物 TN與 nosZ呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與 norB 呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),表明這兩種沉積物環(huán)境因子可以用來作為影響部分反硝化功能基因豐度的指示因子,這與孫許超等(2018)的部分研究結(jié)果一致。與奉化江底泥(顧卿等,2016)和蔬菜地(王軍等,2016)反硝化功能基因豐度相比,本研究太湖沉積物中,nosZ基因豐度較低,原因可能在于總氮水平較低,但也有研究發(fā)現(xiàn),反硝化功能基因豐度與總氮呈負(fù)相關(guān)(高嵩涓等,2017)。在本研究中,盡管反硝化功能基因豐度與亞硝態(tài)氮關(guān)系密切,但太湖沉積物中亞硝態(tài)氮幾乎無積累,且無明顯四季波動(dòng)(表1),故其對nirS和nirK基因豐度影響有限;與銅陵市河流沉積物中 nirS和 nirK基因豐度相當(dāng),季節(jié)變化部分一致(程建華等,2016),但與長江濕地(Hou et al.,2014)和美國河口(Lisa et al.,2014)沉積物反硝化細(xì)菌豐度的季節(jié)變化不一致,由于沉積物及土壤中的反硝化種群具有很高的多樣性,且組成差異很大(Grntzig et al.,2001;Henry et al.,2004),同時(shí)受 pH(Cavigelli et al.,2000)、季節(jié)變化(Mishra et al.,2012)、土地利用方式(Rich et al.,2003)等因素影響,因而導(dǎo)致不同環(huán)境條件下反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)及豐度差異很大。此外,本研究中各反硝化功能基因豐度間均呈顯著正相關(guān)(P<0.01),表明它們對外界環(huán)境因子的變化有基本一致的響應(yīng)。
反硝化過程可以是生成N2O的源,同時(shí)也可能是消耗N2O的匯,是這兩個(gè)過程平衡的結(jié)果(Bange et al.,1996)。亞硝酸鹽還原酶(nirK和 nirS)是反硝化過程中的關(guān)鍵酶,主導(dǎo)亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氧化氮這一步反應(yīng),也是反硝化脫氮過程的限速步驟。研究發(fā)現(xiàn),亞硝酸鹽的積累可直接導(dǎo)致 N2O的排放,N2O排放量隨亞硝酸鹽氮的增加而增大(張靜蓉等,2010),其原因在于高濃度的亞硝酸鹽抑制了N2O還原酶的活性導(dǎo)致N2O的釋放(Itokawa et al.,2001;Alinsafi et al.,2008)。本研究中夏秋季節(jié)nirK和nirS基因豐度高于冬春季,故夏秋季亞硝酸鹽的消耗量大于秋冬季,從而降低了N2O的生成量,這可能是太湖沉積物N2O釋放表現(xiàn)為夏秋季較低、冬春季較高的主要原因。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(表4),夏秋季沉積物nirS和nirK基因豐度與N2O通量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),也符合上述推斷。夏秋季沉積物反硝化功能基因豐度高且與 N2O通量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),這在一定程度也表明反硝化過程進(jìn)行徹底,整體表現(xiàn)為對N2O的消耗而產(chǎn)生負(fù)排放,而且N2O被同化還原為NH4+也會被消耗,導(dǎo)致N2O的負(fù)排放(Vieten et al.,2008)。此外,當(dāng)土壤或沉積物的pH值在6-8,nosZ基因表達(dá)的酶活性不受抑制,產(chǎn)物主要是 N2(馮潔等,2014),太湖夏秋季沉積物間隙水pH值范圍在6.7-7.2(王福芳等,2012),有利于反硝化徹底進(jìn)行,這也是太湖沉積物 N2O在夏秋季表現(xiàn)為負(fù)排放的原因。冬春季沉積物N2O整體表現(xiàn)為排放(圖2),而反硝化功能基因豐度明顯低于夏秋季(圖3),且N2O通量與各反硝化功能基因均不具顯著相關(guān)性(表4),這表明反硝化并不是沉積物N2O產(chǎn)生的主要過程(Liu et al.,2013),這也與 Liu et al.(2018)研究結(jié)果一致。N2O可產(chǎn)生于硝化、反硝化、氨化以及一些化學(xué)過程,同時(shí)也會被反硝化等過程消耗,N2O通量則取決于這些過程中N2O的生成量和消耗量的差減。盡管N2O的生成與反硝化功能微生物關(guān)系密切,但僅從此方面去解釋其與N2O的通量的關(guān)系,以及對反硝化過程影響的機(jī)制仍存在局限性(鄭燕等,2012)。微生物DNA中反硝化功能基因的存在可指示該類微生物的反硝化能力,但并不能認(rèn)為該微生物都能進(jìn)行反硝化基因的表達(dá)(Nogales et al.,2002),因此,盡管大量微生物具有反硝化功能基因,但是否表達(dá),什么特定條件下能表達(dá),仍有待進(jìn)一步研究。然而,由于樣品中RNA提取和保存相對困難,相關(guān)研究仍鮮見報(bào)道。
表4 沉積物N2O通量與反硝化功能基因Pearson相關(guān)性Table4 Pearson correlation analysis betweenN2O flux and denitrificationfunction gene abundance
太湖沉積物反硝化功能基因豐度呈現(xiàn)夏秋季高冬春季低,具有明顯的季節(jié)變化特征。各反硝化功能基因季節(jié)變化規(guī)律一致,表明它們對外界環(huán)境因子的變化有基本一致的響應(yīng)。沉積物TN和NO2-是影響反硝化功能基因豐度的重要環(huán)境因子。反硝化作用并不是沉積物N2O產(chǎn)生的主要過程。