嚴(yán)加坤，劉 莉，周 奇

(榆林學(xué)院 陜西省陜北礦區(qū)生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 榆林 719000)

1 引言

谷子(Setariaitalica)是禾本科狗尾草屬長(zhǎng)型谷物，是世界上栽培歷史最悠久的日常食用的作物之一[1]。榆林市作為陜西谷子的主要盛產(chǎn)區(qū)，是特色雜糧之一，去殼即為小米，米脂縣因盛產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小米而得名。谷子是世界上被馴化的最古老作物之一,栽培歷史悠久,并有眾多證據(jù)證明我國(guó)是谷子的起源中心和遺傳多樣性中心[2]。在未來(lái)幾年，谷子的可持續(xù)發(fā)展以及遺傳優(yōu)育的觀念越來(lái)被人們關(guān)注。

自然界中很多環(huán)境因子如鹽、重金屬、干旱等都會(huì)影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，其中鹽和重金屬是影響最普遍的2種脅迫因子[3]。隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)化學(xué)品的大量應(yīng)用，農(nóng)田土壤重金屬污染日益嚴(yán)重，重金屬由于其生物降解性和持久性受到廣泛的關(guān)注。其中，鎘(Cd)元素具有高移動(dòng)性和高毒害性，被認(rèn)為是危害公眾健康主要物質(zhì)之一[4]。鎘是植物的非必需元素，它的生物毒性極強(qiáng)，毒害貫穿于動(dòng)物、植物、微生物的整個(gè)生命史和其生命現(xiàn)象的各個(gè)過(guò)程，通過(guò)植物的吸收在植物的根、蓮、葉、籽實(shí)中累積[5]。目前，對(duì)谷子體內(nèi)鎘的分布規(guī)律、存在形態(tài)及毒害機(jī)理等方面的研究較多，而鎘的危害首先發(fā)生在谷子種子萌發(fā)期和幼苗期。眾多的研究發(fā)現(xiàn):在鎘的毒害下,可誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生,使谷子的保護(hù)酶活性降低,水稻幼苗葉片膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物含量增加,從而抑制水稻幼苗生長(zhǎng)發(fā)育[11]。當(dāng)谷子幼苗鎘濃度富集過(guò)高時(shí)，谷子就會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀，比如葉片生長(zhǎng)遲緩、葉片變卷曲變黃、產(chǎn)量下降等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致谷子苗死亡。研究表明，用鎘處理不同年代谷子種子，谷子品種的芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率均低于對(duì)照組，高濃度抑制時(shí)，均表現(xiàn)為根長(zhǎng)的降低大于芽長(zhǎng)的降低[6]。

同時(shí)由于本區(qū)鹽堿化嚴(yán)重，鹽害又稱為影響作物生長(zhǎng)的另一個(gè)環(huán)境因子。研究表明，鹽分可延遲水稻種子的萌芽和出苗[7]。水稻種子在萌發(fā)階段受到鹽堿脅迫, 常會(huì)導(dǎo)致種子發(fā)芽不齊, 發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率下降[8]。鹽分對(duì)水稻萌發(fā)期的影響主要是限制種子的生理吸水,影響谷子的萌發(fā)生長(zhǎng), 造成出苗不全[9]。Herralde等的研究表明：即使在植物中去除氯化鈉，鹽脅迫對(duì)植物的毒性也不會(huì)消失[10]。

以往許多學(xué)者對(duì)鎘脅迫和鹽脅迫的谷子積累規(guī)律及其對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響等做了許多研究,取得了可喜的成果，然而有關(guān)鎘脅迫對(duì)不同年代谷子品種的種子萌發(fā)的影響研究較少[11],同時(shí)谷子地方品種具有豐富的遺傳變異, 目前對(duì)谷子耐鹽性的相關(guān)研究也很少[12]。鑒于此，本課題以不同年代谷子品種為材料，研究重金屬鎘及鹽對(duì)不同年代谷子品種的出芽及早期生理指標(biāo)的影響，并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了初步探討，為本區(qū)谷子優(yōu)質(zhì)高抗育種提供理論依據(jù)，此內(nèi)容尚未見(jiàn)報(bào)道。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)的谷子品種為豫谷1號(hào)、豫谷18號(hào)、豫谷31號(hào)，安陽(yáng)市農(nóng)科所提供 。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

磷酸緩沖液(PBS)、氯化鎘、氯化鈉、次氯酸鈉溶液、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、石英砂、GaCO3、3%磺基水楊酸、2.5%茚三酮顯色液、冰乙酸、50 ug·mL-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液、17 mmol·L-1對(duì)氨基苯磺酸、7 mmol·L-1α-萘胺、10 mmol·L-1鹽酸羥胺、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)、磷酸等，所有試劑均為分析純(AR)。

2.3 谷子種子的實(shí)驗(yàn)方法

(1)選種：精心挑選顆粒飽滿且形態(tài)大致均勻的不同年代谷子種子若干粒,先用自來(lái)水沖洗數(shù)次，洗去包衣。

(2)消毒：用1%的次氯酸鈉進(jìn)行消毒處理20 min，

(3)洗滌：用蒸餾水沖洗已消毒的種子若干次。

(4)瀝干：使用漏斗瀝干。

(5)置床：取30粒種子放入鋪有2層濾紙貼上標(biāo)簽的培養(yǎng)皿(φ=8.0 cm)中，在培養(yǎng)皿中分別加入3 mL的相應(yīng)的氯化鎘溶液和鹽溶液，相同濃度均設(shè)3組重復(fù)，然后置于智能光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，控制溫度為25℃使其萌發(fā)。

(6)觀察記錄數(shù)據(jù)，加溶液。

2.4 種子測(cè)定的指標(biāo)及方法

分別于處理后第3天和第7天調(diào)查發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，從各處理中隨機(jī)挑選10粒正常發(fā)芽的種子測(cè)量其根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)并且進(jìn)行各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)參照劉錦川[15～16]的方法，Pro采用磺基水楊酸法[20]測(cè)定，MDA的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[18]，氧自由基含量測(cè)定參考裴帥帥的實(shí)驗(yàn)方法[19]。

發(fā)芽率(GR)(%)= (n/N)×100%

發(fā)芽勢(shì) (GE) (%)= (n/N)×100%

為消除各品種間的各種子發(fā)芽性狀差異，對(duì)各供試水稻品種的萌發(fā)期的各性狀指標(biāo)均采用相對(duì)值，即采用不同CdCl2(NaCl)溶液脅迫濃度下的指標(biāo)值/對(duì)照的指標(biāo)值[17]。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法

所有的數(shù)據(jù)都使用3次重復(fù)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算的，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 CdCl2對(duì)谷子種子萌發(fā)的影響

3.1.1 CdCl2對(duì)谷子芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)的影響

表1 不同濃度對(duì)不同年代谷子品種芽長(zhǎng)的影響

注：同一列相同字母代表沒(méi)有顯著性差異，反之具有顯著性差異，P<0.05。下表同。

表2 不同濃度對(duì)不同年代谷子品種根長(zhǎng)的影響

從圖1和圖2可知，在75 μmol·L-1鎘濃度下,3個(gè)谷子品種的芽長(zhǎng)略低于對(duì)照,豫谷1號(hào)谷子芽長(zhǎng)比對(duì)照少了0.68 cm,豫谷18 號(hào)芽長(zhǎng)比CK少了0.17 cm,豫谷31號(hào)的芽比CK短0.24 cm,鎘對(duì)谷子發(fā)芽具有抑制作用。

不同濃度CdCl2溶液對(duì)不同年代的谷子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響如圖1、圖2所示。除豫谷18號(hào)1 200 μmol·L-1鎘濃度處理下發(fā)芽率明顯下降以外,其他鎘濃度處理的3種谷子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)受鎘濃度的影響不顯著。這說(shuō)明CdCl2能在一定程度上抑制谷子種子的正常萌發(fā)， CdCl2脅迫處理的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)能較好的反映谷子萌發(fā)期的抗逆性。

圖1 不同濃度CdCl2處理對(duì)不同年代谷子種子發(fā)芽勢(shì)的影響

圖2 不同濃度CdCl2處理對(duì)不同年代谷子種子發(fā)芽率的影響

3.1.2 CdCl2對(duì)谷子丙二醛(MDA)含量的影響

表3 CdCl2對(duì)谷子丙二醛(MDA)含量的影響

MDA是衡量氧化脅迫程度的常用指標(biāo)之一，能反映植物體細(xì)胞膜過(guò)氧化的程度，是植物抗性生理研究中的重要指標(biāo)。由圖3可得，在不同濃度鎘溶液處理后3種不同年代谷子的MDA含量均呈現(xiàn)出先下降后上升的變化趨勢(shì)，且在750 μmol·L-1的濃度時(shí)達(dá)到最低時(shí)，3種谷子品種基本均有顯著性差異(p<0.05)，當(dāng)濃度為150 μmol·L-1時(shí)，豫谷1號(hào)的MDA含量為1.4648μmol·L-1，與CK無(wú)顯著性差異(p>0.05),75 μmol·L-1能有效抑制MDA的產(chǎn)生，增強(qiáng)植物體的抗性。當(dāng)鎘濃度上升到1 200 μmol·L-1時(shí)，谷子種子MDA含量則達(dá)到最高，植物生長(zhǎng)被嚴(yán)重抑制。

通過(guò)圖3可以看出，用不同濃度的CdCl2處理過(guò)的谷子品種均對(duì)游離脯氨酸(Pro)含量有一定的影響，在CdCl2溶液濃度為300 μmol·L-1時(shí)，3 種谷子的游離脯氨酸(Pro)含量均達(dá)到最高值，隨著品種的更替，其中豫谷31號(hào)的脯氨酸含量最高，是905.8048 μg·g-1。脯氨酸含量的相對(duì)大小與抗逆性的強(qiáng)弱沒(méi)有關(guān)系。

圖3 CdCl2對(duì)不同年代谷子脯氨酸含量的影響

3.1.3 CdCl2對(duì)氧自由基含量的影響 由表4可以看出，CdCl2脅迫處理組的氧自由基含量都要比CK的要高，說(shuō)明CdCl2脅迫能夠促使谷子產(chǎn)生氧自由基。隨著CdCl2濃度的增加，CdCl2脅迫程度加劇，氧自由基含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但是上升程度不明顯， 這是因?yàn)橹参矬w內(nèi)有自己的一套清除系統(tǒng)。當(dāng)谷子受到脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生POD，POD的主要作用就是分解氧自由基，而在CdCl2脅迫下，氧自由基增加，同時(shí)POD也會(huì)增加，但是氧自由基在CdCl2脅迫下的分解能力較強(qiáng)，因此谷子的氧自由基呈現(xiàn)上升波動(dòng)。

表4 CdCl2對(duì)不同年代谷子自由基含量的影響

3.2 NaCl對(duì)谷子種子的影響

3.2.1 NaCl對(duì)不同年代谷子芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)的影響 在NaCl 溶液為50 mmol·L-1時(shí)，對(duì)豫谷1號(hào)胚芽具有促進(jìn)作用，豫谷18和豫谷31號(hào)均呈現(xiàn)抑制狀態(tài)。150 mmol·L-1NaCl 脅迫對(duì)3種谷子的芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，而且對(duì)根長(zhǎng)受到的抑制比芽長(zhǎng)大。表5和表6中的數(shù)據(jù)表明谷子生長(zhǎng)過(guò)程中胚根對(duì)NaCl脅迫的反應(yīng)比胚芽敏感。研究結(jié)果表明：豫谷1號(hào)生長(zhǎng)的比較好。說(shuō)明豫谷1號(hào)耐鹽性較強(qiáng)。

表5 不同濃度NaCl 脅迫下谷子的芽長(zhǎng)

表6 不同濃度NaCl脅迫下谷子的根長(zhǎng)

3.2.2 NaCl對(duì)丙二醛(MDA)含量的影響 由表7可得，經(jīng)過(guò)不同濃度的NaCl處理后的3種不同年代的谷子，其丙二醛含量均呈現(xiàn)先降低然后升高的趨勢(shì)。NaCl濃度為50 mmol·L-1時(shí)，3種谷子的丙二醛含量低于CK，達(dá)到顯著性水平，對(duì)谷子生長(zhǎng)有利；而高濃度NaCl溶液處理谷子后丙二醛含量上升幅度較為明顯。

表7 NaCl脅迫對(duì)丙二醛(MDA)含量的影響

3.2.3 NaCl對(duì)脯氨酸(Pro)含量的影響 通過(guò)圖4可以看出， 3種谷子被不同濃度的NaCl溶液處理后，其游離脯氨酸(Pro)含量均高于CK。NaCl濃度為50 mmol·L-1時(shí)，豫谷31號(hào)增加的幅度較大；在NaCl溶液為150 mmol·L-1時(shí)，3種谷子的游離脯氨酸(Pro)含量達(dá)到最高。

圖4 NaCl脅迫下不同年代谷子脯氨酸的變化趨勢(shì)

3.2.4 NaCl對(duì)谷子氧自由基含量的影響 氧自由基含量隨著NaCl濃度的增加而增加，結(jié)果表明NaCl脅迫對(duì)3種谷子氧自由基含量影響差異顯著。氧自由基能直接或間接地引起谷子衰變，在這個(gè)過(guò)程中，氧自由基可以對(duì)細(xì)胞組分產(chǎn)生作用，也可以通過(guò)參與氧化分解產(chǎn)物或促進(jìn)乙烯形成而起調(diào)節(jié)作用[21]。NaCl脅迫濃度50 mmol·L-1時(shí)，豫谷31號(hào)相對(duì)于CK影響比較小，增長(zhǎng)幅度不大；高于該濃度時(shí)，豫谷18號(hào)的影響最為顯著，增加了197.6%。

表8 NaCl脅迫對(duì)谷子氧自由基含量的影響

4 討論與結(jié)論

重金屬鎘和鹽脅迫對(duì)谷子種子萌發(fā)有著抑制作用。實(shí)驗(yàn)中各指標(biāo)均采用鎘、鹽脅迫環(huán)境的平均值進(jìn)行研究，消除了品種間固有差異的影響,能更有效的評(píng)價(jià)不同年代谷子的抗逆性。

當(dāng)加入不同濃度的鎘溶液后，谷子種子的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、丙二醛、氧自由基、脯氨酸等指標(biāo)都受到鎘脅迫的影響。由于谷子品種不同、年代不同受促進(jìn)和抑制效果差壓較大。高濃度鎘對(duì)谷子抑制效果明顯。不同的谷子品種對(duì)不同鎘脅迫濃度的耐受力存在顯著差異[13]。鎘濃度大于600 μmol·L-1時(shí)，谷子生長(zhǎng)受到抑制較為明顯，谷子的抗逆性下降，且不同濃度梯度的鎘對(duì)根的脅迫作用大于芽，如果脅迫強(qiáng)度過(guò)高，或脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，有可能植物會(huì)死亡[12]。

萌發(fā)期較強(qiáng)的耐鹽性是鹽漬化嚴(yán)重地區(qū)谷子 品種必須優(yōu)先具備的特性, 相對(duì)芽長(zhǎng)和相對(duì)根長(zhǎng)值較大, 是生產(chǎn)上保證苗全、苗壯的基礎(chǔ)[14]。該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：隨 NaCl 濃度的升高種子的相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)鹽害率均受到鹽的明顯影響, 出現(xiàn)低促高抑現(xiàn)象, 同時(shí)根對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)比芽更敏感[11]。分析原因：植物生長(zhǎng)必需元素的Cl-和Na+，在低濃度下發(fā)揮作用，激活相關(guān)酶活性，促進(jìn)種子萌發(fā)，但高濃度的鹽處理會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，選擇膜滲透性減少或損失，細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂，增加溶液的滲透潛能，高鹽濃度使種子吸力困難，從而抑制萌芽[12]。

由于作物的抗早性是受多基因控制的復(fù)雜性狀,是多個(gè)抗早性狀的綜合反映,對(duì)任何單項(xiàng)機(jī)理的研究都有一定的局限性[22]。