張曉虎，白亞男，殷佳琦，肖秦箭

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

引言

多年生中草藥黃芩，以根入藥，是中國(guó)產(chǎn)地分布較為廣泛的一種傳統(tǒng)大宗植物藥材[1～3]。陜西省商洛地區(qū)適宜黃芩生長(zhǎng)，所產(chǎn)黃芩產(chǎn)量大、品質(zhì)佳、市場(chǎng)前景良好，被譽(yù)為“五大商藥”之一[4]。目前已從黃芩中分離和鑒別出黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、木蝴蝶素A、二氫木蝴蝶素A、千層紙素A和白楊素等超過120種的黃酮糖苷及苷類化合物[5]。

黃芩苷系黃酮衍生物，在黃芩中以羧酸鹽存在，連有葡萄糖醛酸結(jié)構(gòu)，水解后產(chǎn)生黃芩素和葡萄糖醛酸，在常見脂溶性溶劑中均具有一定的溶解度，但只能微溶于熱水。黃芩苷的提取有水提酸沉提取法、堿醇膠胨提取法、超聲提取法、超濾提取法、雙水相分配提取法、超高壓提取法、微波預(yù)處理提取法等多種方法[6,7]；其精制方法也有很多，如重結(jié)晶法、沉淀分離法、高速逆流分離法、大孔樹脂分離法等[8]。已有研究表明，黃芩苷除常用解毒作用外，還具有清除氧自由基、抗氧化、免疫功能調(diào)節(jié)、抗菌及抗病毒、抗腫瘤、腦組織保護(hù)和保肝等功效；此外，黃芩苷具有廣泛的抗菌譜，可以抑制白念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、溶血性鏈球菌、大腸埃希氏菌和沙門氏菌等[9-12]。

中草藥具有的長(zhǎng)期使用不容易引起抗藥性、作用溫和等獨(dú)有特性已為公眾所熟知，如今黃芩中的黃酮類物質(zhì)開發(fā)用作高效、安全的天然抗氧化劑、防腐劑在食品科學(xué)領(lǐng)域已引起人們的關(guān)注[13]。黃芩的非藥用部位如黃芩葉，大多被種植者所丟棄，造成資源浪費(fèi)。筆者以商洛山區(qū)豐富的黃芩葉為原材料，采用操作較為繁瑣但提取得率較高的乙醇回流法提取其中的黃芩苷；并以大腸埃希氏菌作為革蘭氏陰性菌的代表，以金黃色葡萄球菌作為革蘭氏陽性菌的代表，采用比濁法研究黃芩苷的抑菌作用效果，以期提高當(dāng)?shù)攸S芩葉的開發(fā)利用價(jià)值，為黃芩苷在食品防腐保鮮中的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 主要有:

材料：兩年生黃芩葉(2017年10月采摘于陜西省商洛市商州區(qū)黃芩種植基地)。

試劑：黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品；活性炭；甲醇，95%乙醇，均為分析純；鹽酸，氫氧化鈉等。

菌種：大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌。

1.1.2 儀器設(shè)備 研究所用主要儀器設(shè)備見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 原料預(yù)處理 鮮黃芩葉105℃殺青30 min， 40℃恒溫鼓風(fēng)烘干48h至恒重，粉碎后40目篩過篩處理，備用。

表1 主要儀器設(shè)備

1.2.2 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，充分搖勻即得5μg·mL-1黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別吸取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL至6個(gè)10 mL的容量瓶中，以甲醇定容，搖勻即得0.5、1、2、3、4、5 μg·mL-1黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。用甲醇溶液為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)278 nm處用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定各黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，以黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，用Excel繪制黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得線性回歸方程Y=59.778X+0.0019，R2=0.9949。

圖1黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 黃芩葉黃芩苷的提取 主要有:

(1)準(zhǔn)確稱取黃芩葉樣品2 g至試管中，加入70%的乙醇作為提取溶劑。

(2)靜置過夜后置入回流燒瓶，回流提取2次，每次60 min，抽濾并合并兩次提取的濾液。濃縮回收提取溶劑乙醇。

(3)濃縮液水浴加熱至50℃，用鹽酸將pH調(diào)節(jié)至1～2，保溫30 min后，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速4 000 r·min-1離心15 min，取沉淀。

(4)沉淀中加入10倍體積的蒸餾水進(jìn)行攪拌，至完全溶解，用20%的NaOH調(diào)節(jié)pH至中性，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，在4 000 r·min-1離心15 min，取上清液。

(5)上清液水浴加熱至40℃后，加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，并不斷攪拌，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速4 000 r·min-1離心15 min，取上清液。

(6)用鹽酸將上清液pH調(diào)節(jié)至1～2，在80℃下保溫30 min，靜置后，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，在4 000 r·min-1離心15 min，取沉淀，在60℃烘干至恒重，即為黃芩苷粗品[14]。

1.2.4 黃芩苷得率的計(jì)算 準(zhǔn)確稱取40 mg黃芩苷粗品至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后精確移取1 mL樣品液于10 mL容量瓶中，再以甲醇定容并充分搖勻，在278 nm波長(zhǎng)處，測(cè)其吸光度。黃芩苷含量依1.2.2線性回歸方程計(jì)算，見公式(1)；黃芩苷得率計(jì)算，見公式(2)。

(1)

(2)

式中：X-黃芩苷含量，%；Y-黃芩苷得率，%；C-樣品溶液質(zhì)量濃度，mg·mL-1；V-樣品液體積，mL；N-樣品液測(cè)試前稀釋倍數(shù)；M1-吸光度測(cè)定所用黃芩苷質(zhì)量，mg；M2-黃芩苷粗品質(zhì)量，mg；M0-黃芩葉樣品質(zhì)量，mg。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 按1.2.3提取工藝及1.2.4計(jì)算方法，分別考察料液比(1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(60%、65%、70%、75%、80%)、提取溫度(70、75、80、85、90℃)、提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)等4個(gè)因素對(duì)對(duì)黃芩苷得率的影響。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于1.2.5實(shí)驗(yàn)，選取影響黃芩苷得率較大的3個(gè)因素，每個(gè)因素選取較優(yōu)的3個(gè)水平，以L9(33)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以獲得優(yōu)化提取的有關(guān)工藝參數(shù)。

1.2.7 抑菌效果試驗(yàn) 以比濁法評(píng)價(jià)抑菌效果，該方法對(duì)菌濁液稀釋或濃縮，使其吸光度值在0.2～1的范圍內(nèi)，此范圍內(nèi)的所測(cè)吸光度值與濃度之間呈顯著相關(guān)[15]。包括3個(gè)階段：

(1)準(zhǔn)備階段?；罨褐苽洌褐苽鋬煞莼罨?，稱取葡萄糖每份10 g，用蒸餾水配制成10%的溶液，滅菌備用。

菌濁液制備：分別將2種供試菌接種至活化液內(nèi)，置于振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)搖床120 r·min-1，30℃下培養(yǎng)活化1 h。

液體培養(yǎng)基制備：取18個(gè)錐形瓶，編號(hào)1～18，分別稱取牛肉膏2.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉5.0 g、水1 000 mL攪拌加熱至全部溶解，分別倒入18個(gè)錐形瓶中，每個(gè)60 mL，在121℃高壓滅菌20 min，放入4℃冰箱中備用。黃芩苷純化：采用重結(jié)晶法進(jìn)行黃芩苷的純化，即準(zhǔn)確稱取提取所得黃芩苷粗品質(zhì)量后，以10倍的水量加入，用20%的NaOH將pH調(diào)節(jié)至6.5～7，不斷攪拌直至全部的黃芩苷溶解，加入適量的活性炭充分混勻，在80℃條件下水浴保溫30 min，抽濾以使活性炭除去，濾液用HCl將pH調(diào)節(jié)至1～2，添加等體積的95%的乙醇，攪拌至均勻，置于50℃水浴鍋中保溫反應(yīng)30 min，靜置并過夜使沉淀自然析出，經(jīng)過抽濾，以少量95%的乙醇沖洗沉淀后，將沉淀刮取下來，在60℃下烘干，即得黃芩苷純品[16]。

經(jīng)純化處理后的黃芩苷溶液的配制：取純化的黃芩苷0.5 g，用甲醇溶解配制成濃度為1、2、4、6、8、10 mg·mL-1的黃芩苷溶液，備用。

(2)接種與培養(yǎng)階段。在無菌操作臺(tái)向1～6號(hào)錐形瓶?jī)?nèi)各加入1 mL金黃色葡萄球菌的菌濁液，并按次序分別加入6個(gè)濃度的黃芩苷溶液；向7～12號(hào)錐形瓶?jī)?nèi)各加入1 mL大腸埃希氏菌的菌濁液，并按次序分別加入6個(gè)濃度的黃芩苷溶液；向13～18號(hào)錐形瓶?jī)?nèi)依次分別加入6個(gè)濃度的黃芩苷溶液，置搖床120 r·min-1，37℃下培養(yǎng)24 h。

(3)評(píng)價(jià)階段。以在無菌的液體培養(yǎng)基中加入相同濃度的黃芩苷溶液作為對(duì)照，等比例稀釋菌濁液組與對(duì)照組，在278 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。在同一稀釋濃度下，若吸光度值大于對(duì)照組，則說明有菌生長(zhǎng)，且差值越大，菌種生長(zhǎng)越旺盛；若吸光度值小于對(duì)照組，則說明無菌生長(zhǎng)；若吸光度值相同，則說明培養(yǎng)基內(nèi)完全無菌種生長(zhǎng)的黃芩苷溶液最低濃度即為黃芩苷對(duì)該菌種的最低抑制濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比 圖2所示，隨料液比的增大，黃芩苷得率先增大，當(dāng)料液比為1∶12時(shí)，達(dá)到最大為2.01%；料液比超過1∶12后，黃芩苷得率反而減小。究其原因是料液過小且抽濾后濾液更少，使提取不夠充分；料液比過大，加熱時(shí)的負(fù)荷增多，使提取達(dá)到完全程度耗時(shí)增加，在有限時(shí)間內(nèi)提取不完全，致使得率變小。所以，料液比1∶12為宜。

圖2料液比對(duì)黃芩苷得率的影響結(jié)果

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 圖3所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，黃芩苷得率先增大后減小。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，黃芩苷得率僅為1.12%；而70%時(shí)的黃芩苷得率達(dá)到最大為2.02%。這可能是因?yàn)橐掖嫉腕w積分?jǐn)?shù)時(shí)，溶出的水溶性雜質(zhì)量增加，黃芩苷得率較低；70%乙醇與黃芩苷極性相似，利于黃芩苷的溶出，黃芩苷得率最大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)，黃芩苷得率反而逐漸下降，是由于乙醇溶液極性較小，導(dǎo)致黃芩苷得率下降。因此，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)70%為宜。

圖3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃芩苷得率的影響結(jié)果

2.1.3 提取溫度 圖4所示，隨提取溫度的升高，黃芩苷得率有所增加，80℃時(shí)黃芩苷在乙醇中的溶出程度最大，所以得率最高；而高于80℃時(shí)黃芩苷得率開始下降，是因?yàn)辄S芩苷在高溫下極不穩(wěn)定，過高的溫度造成黃芩苷部分分解。因此，選取80℃的提取溫度為宜。

圖4提取溫度對(duì)黃芩苷得率的影響結(jié)果

2.1.4提取時(shí)間 圖5所示，黃芩苷得率隨提取時(shí)間變化趨勢(shì)緩慢，總體上隨時(shí)間的增加先增大后減小，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，黃芩苷得率達(dá)到最大為2.02%；提取時(shí)間超過60 min，黃芩苷得率未升而降。這是因?yàn)辄S芩中的可溶性物質(zhì)如單寧、蛋白質(zhì)、黏液等水溶性和醇溶性雜質(zhì)伴隨提取時(shí)間的增加被更多地溶解釋放出來，從而使黃芩苷分子被包裹起來，導(dǎo)致其向溶液中的擴(kuò)散受阻，以致黃芩苷得率有所下降[17]。但相對(duì)其他三個(gè)因素而言，提取溫度對(duì)黃芩苷得率的影響并不顯著。

圖5提取時(shí)間對(duì)黃芩苷得率的影響結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在固定提取時(shí)間60 min的前提下，選取對(duì)黃芩苷得率影響較大的料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取溫度(C)3個(gè)因素，每因素選取3個(gè)水平，采用L9(33)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

由表2直觀分析可知，B的極差較大、其次為A、再次為C，因此，對(duì)黃芩苷得率的影響因素排列為：B>A>C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>提取溫度；得到的提取黃芩苷最優(yōu)工藝組合為A2B1C2，即在提取時(shí)間60 min的條件下為：料液比1∶12、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度80℃，黃芩葉中黃芩苷得率2.03%。

表2 L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在黃芩苷提取的最優(yōu)工藝下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，取3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，驗(yàn)證該條件下黃芩苷得率的穩(wěn)定性。即準(zhǔn)確稱取黃芩葉樣品2g，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液浸泡過夜，料液比為1∶12，在80℃下回流提取2次，每次60 min，按1.2.3的方法進(jìn)行黃芩苷的提取，并按1.2.4的方法計(jì)算黃芩苷得率，結(jié)果見表3。

由表3可知，3次實(shí)驗(yàn)的黃芩苷得率穩(wěn)定，表明采用乙醇回流法對(duì)黃芩葉中的黃芩苷進(jìn)行提取的優(yōu)化工藝可行。

2.4 抑菌效果試驗(yàn)結(jié)果與分析

黃芩葉中的黃芩苷對(duì)2種供試菌的抑菌效果試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 黃芩苷提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注: 表中“+ ”表示同稀釋濃度下的吸光度值>對(duì)照組；“-”表示吸光度值<對(duì)照組，即無菌生長(zhǎng)。

由表4可知，在金黃色葡萄球菌的菌濁液添加黃芩苷溶液濃度超過4 mg·mL-1時(shí)，表現(xiàn)出抑菌效果；在大腸埃希氏菌的菌濁液添加黃芩苷溶液濃度超過8 mg·mL-1時(shí)，表現(xiàn)出抑菌效果。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

研究以采集的商洛黃芩葉片為原料，設(shè)置正交試驗(yàn)用于探討乙醇回流法提取黃芩苷的工藝條件，試驗(yàn)得到的優(yōu)化提取工藝參數(shù)為：當(dāng)料液比1∶12，采用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，在80℃下回流提取兩次，每次60 min，黃芩苷得率達(dá)2.03%。

分別以革蘭氏陰性菌中的大腸埃希氏菌、革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌種，用最小抑制濃度評(píng)價(jià)黃芩苷的抑菌效果，試驗(yàn)表明：菌濁液中添加黃芩苷溶液濃度大于4 mg·mL-1時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出抑制作用；添加黃芩苷溶液濃度大于8 mg·mL-1時(shí)，對(duì)大腸埃希氏菌表現(xiàn)出抑制作用。

3.2 討論

一般黃芩除藥用部位其干燥根入藥外，其他非藥用部位大多被丟棄，且目前對(duì)黃芩葉中活性成分研究又較少，使黃芩葉資源利用不夠充分。筆者對(duì)黃芩葉中的有效成分黃芩苷提取并進(jìn)行抑菌效果研究，其初步成果將能夠作為食品防腐保鮮的技術(shù)參考，有利于促進(jìn)黃芩葉資源的綜合利用。

試驗(yàn)得出的優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以及影響黃芩苷提取得率的因素排序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>料液比>提取溫度等，與雷燕妮等人的研究結(jié)果基本一致[18]；黃芩苷對(duì)供試菌的抑菌效果與張有志等人試驗(yàn)結(jié)論基本一致[19]。

試驗(yàn)對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用的黃芩苷溶液濃度大于4 mg·mL-1，而孫冬梅等[20]的研究表明對(duì)金黃色葡萄球菌起抑制作用的黃芩苷濃度最低為2 mg·mL-1。這可能是由于黃芩苷的純化過程中加入的活性炭過少，導(dǎo)致純化的不完全，仍含有部分雜質(zhì)，使得出的最低抑菌濃度偏高，也可能是因?yàn)檫x用的黃芩苷溶液濃度梯度過少，導(dǎo)致結(jié)果存在一定偏差。