史建國，陳宇東

(解放軍第二五二醫(yī)院泌尿外科，河北 保定 071000)

尿道狹窄嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，并易繼發(fā)感染、膀胱結(jié)石、尿瘺、敗血癥等，并最終導(dǎo)致腎功能衰竭。尿道狹窄的發(fā)病率為2‰～12‰，55歲以上人群的發(fā)病率呈明顯升高的趨勢[1]。在美國，每年在門診就診的男性尿道狹窄患者約150萬人次，住院約5 000人次[2]。復(fù)雜性尿道狹窄常導(dǎo)致尿道缺損，因缺乏重建所需的自體組織，治療起來非常棘手。傳統(tǒng)替代組織為自體外生殖器皮膚、膀胱黏膜以及口腔黏膜等。自體組織取材后取材部位常發(fā)生各種并發(fā)癥，如神經(jīng)損傷、出血、血腫形成、口腔感覺異常等[3]。此外，自體組織來源有限，尤其是需要大面積材料或病變復(fù)發(fā)時，不足以提供充足的材料。因此，當(dāng)前這種犧牲自體組織以傷治傷的方法無法滿足臨床需求。

組織工程與再生醫(yī)學(xué)為尿道組織工程重建提供了新方法。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，組織工程學(xué)被定義為應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)原理開發(fā)恢復(fù)、維持或改善組織功能或整個器官的生物替代物的交叉學(xué)科[4]。已有研究開始嘗試使用新型材料和各種種子細(xì)胞(尤其是干細(xì)胞)進(jìn)行尿道重建以修復(fù)尿道缺損[5]?，F(xiàn)對目前研究中的新型材料和種子細(xì)胞予以綜述。

1 種子細(xì)胞在尿道組織工程修復(fù)中的應(yīng)用

早在20世紀(jì)80年代，人類就已經(jīng)邁出了尿道組織工程的第一步：培養(yǎng)尿路上皮細(xì)胞。最初，這些體外培養(yǎng)的細(xì)胞只是用來研究外源性物質(zhì)對組織的影響。當(dāng)組織工程學(xué)進(jìn)一步發(fā)展時，培養(yǎng)細(xì)胞的目標(biāo)變?yōu)樘鎿Q受損或缺失的器官。后一種策略的基本原理是用有限數(shù)量的組織(小塊組織活檢)，通過細(xì)胞培養(yǎng)擴增，獲得更多的自體細(xì)胞用于移植。由于是自體細(xì)胞，所以排斥反應(yīng)可以忽略。植入體內(nèi)時，因組織具有與周圍組織相似的性質(zhì)，從而達(dá)到了組織替代的目的。這種方法避免了因大塊組織取材而導(dǎo)致的并發(fā)癥，并最大限度地減少了患者的損傷及痛苦。組織再生包含纖維蛋白沉積、再上皮化、組織重塑，這個過程受限于組織缺損的大小。瘢痕形成源于器官本身細(xì)胞在缺損處的再生缺乏。組織工程尿道策略可分為兩類：①使用不含細(xì)胞的基質(zhì)材料修復(fù)尿道缺損部位。這種方法以脫細(xì)胞基質(zhì)材料為依托，再生主要依賴組織修復(fù)的自然進(jìn)程。②使用一種攜帶細(xì)胞的支架材料修復(fù)病變的尿道。目前研究證實了細(xì)胞種植會減少瘢痕形成，并促進(jìn)工程化尿道組織的再生及血管化[6]。有研究表明，用無細(xì)胞的基質(zhì)修復(fù)缺損范圍超過1 cm的管狀尿道會導(dǎo)致組織攣縮、纖維增生以及鈣化等，最終導(dǎo)致尿道狹窄復(fù)發(fā)[7]。Dorin等[8]建立家兔尿道狹窄模型發(fā)現(xiàn)，當(dāng)尿道管狀替代距離超過0.5 cm時，用無細(xì)胞支架材料進(jìn)行管狀尿道替代易導(dǎo)致狹窄的再發(fā)生。在尿道組織工程重建研究中，攜帶細(xì)胞的材料明顯優(yōu)于無細(xì)胞種植材料。

1.1成體細(xì)胞 文獻(xiàn)報道的尿道組織工程使用的種子細(xì)胞種類較多，包括口腔黏膜角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、包皮表皮細(xì)胞、膀胱尿路上皮細(xì)胞、膀胱平滑肌細(xì)胞、網(wǎng)膜細(xì)胞等。Orabi等[9]以犬為實驗對象，使用膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建管狀結(jié)構(gòu)，種植尿路上皮及平滑肌細(xì)胞，形成組織工程尿道，修復(fù)6 cm長的尿道缺損。觀察1年發(fā)現(xiàn)，組織工程尿道寬敞無狹窄發(fā)生，而無細(xì)胞種植的支架材料發(fā)生了管腔狹窄和閉鎖。De Filippo等[10]用膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)種植自體膀胱尿路上皮及平滑肌細(xì)胞，最終形成了尿道形態(tài)的管狀結(jié)構(gòu)。該研究發(fā)現(xiàn)，種植了細(xì)胞的支架材料組術(shù)后尿道管腔寬闊，而未種植細(xì)胞的支架材料組管腔塌陷并出現(xiàn)尿道狹窄。Xie等[11]以絲素蛋白基質(zhì)，以口腔黏膜角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞，制作了組織工程口腔黏膜用于修復(fù)犬5 cm長的尿道缺損。研究發(fā)現(xiàn)，植入組織工程黏膜的犬排尿通暢，術(shù)后6個月行逆行尿道造影檢查提示尿道管腔通暢無狹窄[11]。Gu等[12]取網(wǎng)膜組織培養(yǎng)網(wǎng)膜細(xì)胞，擴增后種植于膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)表面，形成網(wǎng)膜樣組織，將形成的組織工程腹膜樣管狀組織替代尿道。

1.2干細(xì)胞 在人體所有的組織中都可以找到干細(xì)胞，這些干細(xì)胞具有自我更新、長期生存以及在特定微環(huán)境下多向分化的潛能。因具有控制穩(wěn)態(tài)、再生以及修復(fù)組織的作用，對再生醫(yī)學(xué)至關(guān)重要[13-15]。要將干細(xì)胞應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)，必須滿足在無創(chuàng)或微創(chuàng)條件下大批獲取的條件。此外，干細(xì)胞的分化過程及分化途徑是以一種可重復(fù)的方式進(jìn)行，并且需要保證將其移植到自體或異體宿主的過程是安全有效的。根據(jù)來源不同，干細(xì)胞可以分為胚胎干細(xì)胞[16]、胎兒干細(xì)胞[17]以及成體干細(xì)胞[18]。在這些干細(xì)胞中，胚胎干細(xì)胞的分化潛能最大，但倫理學(xué)問題限制了應(yīng)用。

在成體干細(xì)胞中，對間充質(zhì)干細(xì)胞的研究較多，尤其是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在特定環(huán)境下都具有向平滑肌細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞分化的潛能。然而與脂肪干細(xì)胞相比較，獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法創(chuàng)傷性大，獲取效率低下，擴增速度慢，這些缺點限制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用。而脂肪干細(xì)胞分布廣泛，易于獲取，取材創(chuàng)傷小，增殖效率高，并具有向上皮細(xì)胞分化的潛能[19]。此外，脂肪干細(xì)胞還能夠分泌多種營養(yǎng)因子刺激細(xì)胞增殖分化，并使多種細(xì)胞遷移。脂肪干細(xì)胞分泌的營養(yǎng)因子以及旁分泌效應(yīng)對于其在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用至關(guān)重要[20]。Li等[21]用膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)種植脂肪干細(xì)胞分化的上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞來源的上皮細(xì)胞可以替代尿路上皮細(xì)胞用于尿道組織工程，并在預(yù)防尿道管腔狹窄以及各種并發(fā)癥方面具有優(yōu)勢。杜小文等[22]取雄性新西蘭大白兔附睪旁的脂肪組織分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以Ⅰ型膠原蛋白表面修飾的聚乳酸乙酸共聚物膜為組織工程材料，構(gòu)建內(nèi)縱外螺旋雙層結(jié)構(gòu)的管狀尿道支架，采用一次沉淀法將轉(zhuǎn)染的脂肪干細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分別種植于尿道支架的內(nèi)外層，構(gòu)建管狀尿道支架復(fù)合體，并將其包埋于實驗動物腹股溝皮下血管旁，3周后采用帶血管蒂轉(zhuǎn)移皮管修復(fù)尿道缺損。結(jié)果表明，這種攜帶干細(xì)胞的管狀尿道支架復(fù)合體是修復(fù)長段尿道缺損較為合理的方法。

除脂肪干細(xì)胞外，也可從尿液中分離出干細(xì)胞，稱為尿源性干細(xì)胞。尿源性干細(xì)胞具有多向分化潛能，可分化為平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，具有取材方便、安全、無損傷等優(yōu)點[23]。尿源性干細(xì)胞可用于壓力性尿失禁、膀胱輸尿管反流以及膀胱尿道組織工程等的研究[24-25]。Liu等[5]將培養(yǎng)的家兔尿源性干細(xì)胞種植在用5%過氧乙酸處理過的小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料上進(jìn)行尿道重建，這種干細(xì)胞復(fù)合支架材料適用于復(fù)雜性長段尿道狹窄的重建。雖然尿源性干細(xì)胞可用于組織工程修復(fù)，但其數(shù)量和純度均十分有限，因而此方面的研究尚有待深入。

2 應(yīng)用于尿道組織工程修復(fù)的新型生物材料

種子細(xì)胞對成功進(jìn)行組織工程尿道重建具有至關(guān)重要的作用，但僅僅使用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行尿道重建會因為缺乏承載細(xì)胞的載體而難以成功。支架材料解決了細(xì)胞的承載問題，并具備一定的機械性能。理想的支架材料應(yīng)具備良好的生物相容性、生物可降解性、可吸收性，能促進(jìn)種植細(xì)胞的增殖，促進(jìn)植入?yún)^(qū)域原位細(xì)胞的滲透性生長，并具有良好的機械和物理學(xué)性能。用于修復(fù)尿道的組織工程支架主要分為兩種，一種是含有多種多聚物的合成支架，即可降解高分子材料，代表材料有聚乳酸、聚羥基乳酸等[3]；另一種是取自各組織的脫細(xì)胞基質(zhì),如脫細(xì)胞真皮組織、脫細(xì)胞小腸黏膜下層、脫細(xì)胞膀胱黏膜[21]等，其他新型材料如細(xì)胞膜片[26]、靜電紡絲絲素蛋白支架等[27]。

2.1脫細(xì)胞基質(zhì)材料 脫細(xì)胞基質(zhì)，又稱為無細(xì)胞膠原基質(zhì)材料，是一種良好的生物支架材料。這種材料是通過脫細(xì)胞處理生物組織而獲得，其優(yōu)點是低抗原性和良好的生物趨化性。脫細(xì)胞基質(zhì)中含有一些細(xì)胞黏附和分化所必需的生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子以及上皮生長因子等。此外，因保留了細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，這類材料具有接近細(xì)胞外基質(zhì)的生物力學(xué)性能和細(xì)胞網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。源于小腸黏膜下層、膀胱黏膜、口腔黏膜的脫細(xì)胞基質(zhì)已成功用于動物研究，并已嘗試在臨床應(yīng)用[28]。目前脫細(xì)胞基質(zhì)材料主要來源于豬，但其存在倫理學(xué)問題，并具有傳播疾病的可能。此外，由于脫細(xì)胞基質(zhì)材料取自不同個體，不同批次材料之間的蛋白及膠原含量不一致，導(dǎo)致材料的可控性差。雖然脫細(xì)胞基質(zhì)材料具有有效性，但應(yīng)用脫細(xì)胞基質(zhì)材料進(jìn)行尿道組織工程重建的研究始終處于臨床前的實驗階段。

2.2人工合成多聚物 人工合成多聚物具有較好的機械力學(xué)性能，在體內(nèi)經(jīng)生物降解轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水，通過人體正常的組織代謝排出體外。此類材料不需進(jìn)行組織獲取，避免了組織獲取帶來的倫理學(xué)問題、傳播疾病的風(fēng)險以及可控性差等問題。此外，由于人工合成多聚物可以成規(guī)模生產(chǎn)，材料的三維結(jié)構(gòu)、孔隙率、機械性能等都在可控范圍，且成本低廉，易于推廣。人工合成多聚物的缺點是缺乏細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，這些細(xì)胞外基質(zhì)蛋白具有重要的生物學(xué)功能，可參與支持細(xì)胞的增殖與分化。另外，人工合成多聚物往往具有疏水表面，且無相應(yīng)的信號分子，導(dǎo)致細(xì)胞難以黏附在支架材料上，從而無法進(jìn)入支架材料內(nèi)部發(fā)揮種子細(xì)胞的功能[29]。

2.3其他新型材料的探索 由于天然衍生材料和人工合成材料均存在局限性，因而研究者嘗試采用新型材料(如細(xì)胞膜片材料、基因轉(zhuǎn)染抗瘢痕材料、攜帶緩釋血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子納米微球材料、靜電紡絲絲素蛋白材料等)用于組織工程尿道修復(fù)，這些新型材料集人工材料和天然衍生材料的優(yōu)點，在促進(jìn)愈合、減少瘢痕、促進(jìn)局部血運等方面均具有優(yōu)越性。

Ram-Liebig等[30]使用新型組織工程材料TEOMG進(jìn)行尿道球部和陰莖部重建，結(jié)果表明該材料安全有效，在12～24個月的隨訪中大部分患者的療效較好。Zhou等[26]采用少許口腔黏膜組織和脂肪組織分離并培養(yǎng)口腔黏膜上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及脂肪干細(xì)胞，在體外環(huán)境下利用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，制作出一種含有三層細(xì)胞的膜片樣結(jié)構(gòu)，將這種膜片樣結(jié)構(gòu)的組織工程尿道植入皮下組織以促進(jìn)植入物的血管化，并提高生物機械性能。3周后將組織工程尿道取出后原位植入，用于修復(fù)2 cm長的尿道。3個月后發(fā)現(xiàn)該組織工程尿道能夠基本模擬正常尿道的功能。細(xì)胞膜片技術(shù)是一種不需要基質(zhì)材料的技術(shù)，是在體外環(huán)境下培養(yǎng)含有三層不同類型細(xì)胞的細(xì)胞膜片，這種膜片本身具有良好的機械性能，適合于外科操作。

Li等[31]獲取口腔角質(zhì)細(xì)胞，并用轉(zhuǎn)化生長因子β1基因轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種植在預(yù)制的支架材料上以構(gòu)建新型抗瘢痕形成的尿道支架，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將這種材料原位植入尿道后達(dá)到了抗瘢痕形成的作用。Wang等[32]制作了一種緩釋血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子納米微球修飾的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料，并成功進(jìn)行了家兔的前尿道重建。研究發(fā)現(xiàn)這種新型支架材料可促進(jìn)植入部位的血管化。蠶蛹經(jīng)Na2CO3、水溶液充分處理后，脫去能引起炎癥反應(yīng)的絲膠，得到絲素蛋白，利用靜電紡絲絲技術(shù)制備具有多孔三維立體結(jié)構(gòu)的絲素蛋白尿道支架，將制備完成的靜電紡絲絲素蛋白材料放置于90%的乙醇中進(jìn)行拉伸處理顯著提高了材料的機械強度[33]。將移行上皮細(xì)胞種植于靜電紡絲絲素蛋白材料上，細(xì)胞生長良好，形成了類似天然尿路的多層移行上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使用復(fù)合尿路上皮細(xì)胞的絲素蛋白材料修復(fù)3 cm長的尿道黏膜缺損發(fā)現(xiàn)，術(shù)后6個月內(nèi)未發(fā)生尿道狹窄、尿瘺等并發(fā)癥[33]。

3 展 望

尿道狹窄的組織工程重建給尿道狹窄的治療帶來了希望與挑戰(zhàn)。干細(xì)胞和新型支架材料成為未來解決這一難題的關(guān)鍵。新型支架材料包括含有人工合成和天然成分的混合支架材料、細(xì)胞膜片支架材料以及含有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和生長因子修飾的人工合成支架等[34]，這些新型支架材料可在體內(nèi)原位刺激細(xì)胞的再生過程。此外，3D生物打印技術(shù)[35]是以含有細(xì)胞的凝膠為原料進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)打印，以制作新型支架材料，但尚未有應(yīng)用于尿道組織工程重建的報道，在不久的將來可能成為最有發(fā)展?jié)摿Φ纳镏Ъ懿牧稀?/p>