徐婷婷，韓繼武

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化科，哈爾濱 150001)

腫瘤是威脅人類(lèi)生命健康的難治疾病，腫瘤細(xì)胞利用自身的高突變性逃避免疫監(jiān)視，抑制免疫反應(yīng)[1]；同時(shí)，腫瘤細(xì)胞可進(jìn)行無(wú)限復(fù)制、轉(zhuǎn)移、侵襲組織，最終導(dǎo)致器官衰竭甚至死亡。雖然現(xiàn)有的治療方法在不斷改善，并出現(xiàn)了新的創(chuàng)新療法，但新病例數(shù)每年都在增加[2]。通過(guò)避免暴露于常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素，如煙草、煙霧、酒精和核輻射等，可以預(yù)防一部分腫瘤的發(fā)生；此外，通過(guò)手術(shù)、放療、化療、激素和單克隆抗體治療可以治愈一部分腫瘤，特別是一些發(fā)現(xiàn)較早的腫瘤。但這些針對(duì)腫瘤患者的治療方法常在治療后出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。理想的腫瘤治療劑是可以選擇性地殺死惡性細(xì)胞，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞和組織沒(méi)有副作用。溶瘤病毒療法是指通過(guò)選取自然界中存在的一些致病力較弱的病毒株或通過(guò)對(duì)某些病毒進(jìn)行有目的性的基因改造而形成的具有靶向及殺傷腫瘤細(xì)胞功能的病毒來(lái)治療腫瘤的一種新方法[3]。其中，新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)可以特異地殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有傷害，是安全、有效的溶瘤試劑[4]。NDV本身的高靶向性及分子生物技術(shù)的成熟使其在癌癥治療中的應(yīng)用研究越來(lái)越深入?，F(xiàn)就NDV抗惡性腫瘤研究進(jìn)展予以綜述。

1 NDV的腫瘤選擇性

NDV是一種有包膜、非節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，為副黏病毒亞科的禽副黏病毒屬，共編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白、磷蛋白、基質(zhì)蛋白、融合蛋白、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白和大聚合酶蛋白。核衣殼蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合物，負(fù)責(zé)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[5]；血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白和融合蛋白作為表面糖蛋白錨定在病毒包膜中，其中血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞受體的連接，融合蛋白負(fù)責(zé)宿主細(xì)胞膜與病毒包膜相融合[6]。

所有RNA病毒的復(fù)制生命周期均涉及雙鏈RNA的形成，該雙鏈RNA結(jié)構(gòu)激活基于Ⅰ型干擾素的重要細(xì)胞防御系統(tǒng)(α干擾素和β干擾素細(xì)胞防御系統(tǒng))發(fā)揮清除病毒的作用。突變的腫瘤細(xì)胞通常會(huì)使干擾素系統(tǒng)癱瘓，使防御系統(tǒng)細(xì)胞增殖受到抑制，清除病毒能力下降[7]。故突變的腫瘤細(xì)胞允許NDV在其自身腫瘤細(xì)胞中大量復(fù)制。NDV的腫瘤選擇性機(jī)制可概括為：抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活的缺陷、Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的缺陷[8]。

NDV對(duì)細(xì)胞的感染包括兩個(gè)步驟：①細(xì)胞結(jié)合、膜融合、病毒基因組的轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄。②使用新生成的核衣殼作為基因組進(jìn)行病毒復(fù)制。NDV感染人或小鼠的正常細(xì)胞通常不會(huì)進(jìn)入第二步，但在幾乎所有測(cè)試的人或小鼠腫瘤細(xì)胞中，NDV感染均進(jìn)行到第二步，允許腫瘤選擇性復(fù)制[9]。與大多數(shù)人類(lèi)正常細(xì)胞相比，NDV在人類(lèi)腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制速度增加了10 000倍。

2 NDV的抗腫瘤作用機(jī)制

2.1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡 研究表明，NDV能夠通過(guò)觸發(fā)內(nèi)在線(xiàn)粒體途徑和外在死亡受體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。在線(xiàn)粒體途徑中，NDV感染在降低腫瘤細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的同時(shí)釋放細(xì)胞色素C和其他膜間隙蛋白，激活下游胱天蛋白酶9，產(chǎn)生凋亡小體并激活下游胱天蛋白酶3，從而引起腫瘤細(xì)胞凋亡。已檢測(cè)到NDV血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白誘導(dǎo)被感染腫瘤細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，并與其相應(yīng)死亡受體結(jié)合形成死亡受體復(fù)合物，通過(guò)Fas相關(guān)蛋白和死亡結(jié)構(gòu)域的中間銜接蛋白激活胱天蛋白酶8。內(nèi)在線(xiàn)粒體途徑和外在死亡受體途徑最終將促進(jìn)機(jī)體啟動(dòng)胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而胱天蛋白酶通過(guò)裂解核蛋白及相關(guān)細(xì)胞器來(lái)造成腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。迄今為止，NDV介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡所產(chǎn)生的溶瘤效果已在乳腺癌[12]、宮頸癌[13]、結(jié)直腸癌[14]等惡性腫瘤中被證實(shí)。

2.2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡 自噬是一種分解代謝且高度保守的細(xì)胞過(guò)程。它的基本作用是在營(yíng)養(yǎng)饑餓和其他壓力條件下回收細(xì)胞成分，并被認(rèn)為是細(xì)胞保護(hù)事件[15]。對(duì)于NDV，只有少數(shù)研究探索病毒感染期間自噬的誘導(dǎo)和影響。而自噬似乎是NDV介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡反應(yīng)的重要組成部分，并在感染早期觸發(fā)。NDV感染腫瘤細(xì)胞的早期階段產(chǎn)生的自噬反應(yīng)能夠防止腫瘤細(xì)胞的過(guò)早消除，有益于病毒自身的復(fù)制和存活，并在感染后期誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。Meng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，NDV可觸發(fā)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中自噬體的形成，表現(xiàn)為膠質(zhì)瘤細(xì)胞在感染病毒后顯示完全自噬通量、自噬蛋白早期的增加和持續(xù)存在以及自噬底物p62的逐漸減少。且使用自噬正調(diào)節(jié)劑雷帕霉素病毒的產(chǎn)量增加，使用自噬抑制劑氯喹病毒的產(chǎn)量減少。有研究表明，敲除自噬相關(guān)基因可導(dǎo)致NDV復(fù)制產(chǎn)量減少[17]，再次證明自噬有益于細(xì)胞中NDV的復(fù)制。為闡明早期階段自噬能夠抑制腫瘤細(xì)胞的過(guò)早清除，Meng等[18]研究了人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞對(duì)NDV感染的反應(yīng)。他們觀(guān)察到，感染細(xì)胞中p62依賴(lài)性線(xiàn)粒體自噬過(guò)程的誘導(dǎo)，導(dǎo)致NDV感染時(shí)受損線(xiàn)粒體的消除、細(xì)胞色素C釋放減少，從而抑制腫瘤細(xì)胞過(guò)早消除。

2.3誘導(dǎo)抗腫瘤免疫 免疫原性細(xì)胞死亡是細(xì)胞死亡的重要形式，其能誘導(dǎo)強(qiáng)效抗腫瘤免疫的危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(鈣網(wǎng)蛋白、熱激蛋白、高遷移率族蛋白1等)的釋放[19]。這些關(guān)鍵危險(xiǎn)相關(guān)分子模式不僅可以激活一些先天免疫細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)，還可以活化腫瘤特異性T細(xì)胞，同時(shí)將抗原呈遞細(xì)胞吸引到腫瘤組織來(lái)啟動(dòng)免疫應(yīng)答。與傳統(tǒng)免疫原性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑一樣，溶瘤病毒亦是很有潛力的免疫原性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑[20]。Ye等[21]的研究顯示，溶瘤性NDV能在體外觸發(fā)人肺癌細(xì)胞免疫原性細(xì)胞死亡并使鈣網(wǎng)蛋白暴露、高遷移率族蛋白1和熱激蛋白釋放，而來(lái)自NDV感染肺癌細(xì)胞的上清液在異種移植物模型中能減少腫瘤的形成，表明NDV誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞死亡具有免疫原性，并與主要免疫原性細(xì)胞死亡決定簇(鈣網(wǎng)蛋白、高遷移率族蛋白1、熱激蛋白)的釋放有關(guān)。同時(shí)，肺癌細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的消耗顯著抑制了NDV對(duì)免疫原性細(xì)胞死亡決定簇的誘導(dǎo)，證明自噬在NDV誘導(dǎo)的免疫原性細(xì)胞死亡中起一定作用。在原位小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中，NDV不僅能誘導(dǎo)鈣網(wǎng)蛋白、熱激蛋白和高遷移率族蛋白1釋放，還能誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫T細(xì)胞記憶[22]。

NDV除了能誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡釋放危險(xiǎn)相關(guān)分子模式改變免疫抑制性腫瘤微環(huán)境外，其病原體相關(guān)分子模式(雙鏈RNA、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白等)還可以被先天免疫細(xì)胞的相關(guān)模式識(shí)別受體識(shí)別，啟動(dòng)多種反應(yīng)途徑，最終誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放和免疫細(xì)胞的激活[9]。此外，NDV感染還可以打破機(jī)體腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫療法的抵抗。研究證明，人類(lèi)T細(xì)胞對(duì)黑素瘤的耐受性能被NDV的感染破壞；同時(shí)在小鼠黑色素瘤模型中，局部溶瘤性NDV療法被證明可以克服對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷免疫療法的系統(tǒng)性腫瘤抗性[23]。這為臨床研究免疫檢查點(diǎn)阻斷劑與溶瘤性NDV聯(lián)合治療提供了強(qiáng)有力的理論依據(jù)。

3 NDV為載體的抗腫瘤治療作用

雖然NDV是腫瘤治療的理想候選者，但其溶瘤效果仍需提高。近年來(lái)，反向遺傳學(xué)技術(shù)提供了一種可用于研究和開(kāi)發(fā)具有更強(qiáng)溶瘤能力的NDV方法。該技術(shù)是在體外將NDV基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA，在DNA分子水平上對(duì)其進(jìn)行各種體外人工操作(外源基因的插入)，再將NDV基因組的互補(bǔ)DNA轉(zhuǎn)染適當(dāng)細(xì)胞以獲得重組NDV(recombinant newcastle disease virus，rNDV)。現(xiàn)已應(yīng)用該技術(shù)構(gòu)建了許多表達(dá)外源基因的rNDV[24-27]，其與親本病毒相比表現(xiàn)出更強(qiáng)的腫瘤治療效果。

3.2增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用 腫瘤抑制因子是一種應(yīng)激激活轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)多種基因的功能，包括DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯、代謝和衰老。在大約50%的人類(lèi)腫瘤中，腫瘤抑制因子發(fā)生基因突變并喪失其功能，故恢復(fù)腫瘤抑制因子的活性來(lái)預(yù)防腫瘤形成或?qū)е履[瘤消退是一種潛在治療方法[37]。p53作為轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的功能，如促凋亡蛋白、胱天蛋白酶、死亡受體等[38]。表達(dá)p53基因的rNDV能使肝癌細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位降低，這是腫瘤細(xì)胞開(kāi)始凋亡的關(guān)鍵步驟[39]。同時(shí)，其還能使膠質(zhì)瘤細(xì)胞中p53下游蛋白p21和胱天蛋白酶3的轉(zhuǎn)錄活性顯著上調(diào)，并顯著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bim和Bax的表達(dá)[40]，表明p53基因的插入提高了NDV誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。為補(bǔ)充和增加NDV的促凋亡能力，Cuadrado-Castano等[41]構(gòu)建了編碼人腫瘤壞死因子受體Fas的rNDV，感染期間Fas受體的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)外源性凋亡途徑的上調(diào)和細(xì)胞死亡水平的升高。與親本NDV相比，用表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體的rNDV處理小鼠的腫瘤組織中可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞排列松散、腫瘤細(xì)胞體積減小、腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核固縮及更多壞死病灶[42]?？梢?jiàn)，使用NDV為載體遞送外源治療基因可以顯著增強(qiáng)促腫瘤細(xì)胞凋亡作用，是治療腫瘤的理想方法。

4 小 結(jié)

惡性腫瘤是全球人類(lèi)死亡的常見(jiàn)原因，但目前的治療方法并未大大提高患者的生存率，尤其是轉(zhuǎn)移瘤。插入外源治療基因的rNDV代表一類(lèi)新的具有增強(qiáng)NDV治療效果的獨(dú)特生物制劑，其優(yōu)勢(shì)在于：①rNDV維持了親本病毒的安全性；②rNDV可以穩(wěn)定表達(dá)外源治療基因的功能；③rNDV仍然保留親本病毒的腫瘤殺傷能力，且能夠增強(qiáng)宿主抗腫瘤免疫應(yīng)答。但其抗腫瘤的效果有待進(jìn)一步研究。未來(lái)，可探索NDV的外源基因最佳插入位點(diǎn)，使外源治療基因達(dá)到最高表達(dá)水平，且對(duì)NDV復(fù)制影響最??；同時(shí)，也可探索最佳注射時(shí)間和注射次數(shù)以?xún)?yōu)化治療效果。