劉栓桃 張志剛 王榮花 王立華 李巧云 趙智中

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，國家蔬菜改良中心山東分中心，山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100）

大白菜〔Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour）Olsson〕又稱結(jié)球白菜，屬于十字花科蕓薹屬，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培，是我國乃至東亞許多國家主要的蔬菜作物之一。我國是大白菜主要起源地，種質(zhì)資源豐富，山東省又是我國大白菜種質(zhì)資源最豐富的省份之一，其中沿海地區(qū)以合抱類型為主，魯東南山區(qū)和魯中南山區(qū)以疊抱類型為主（譚其猛，1979）。20世紀(jì)80～90年代山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所大白菜課題組張煥家老師收集、保存了大批優(yōu)質(zhì)合抱類型與疊抱類型大白菜種質(zhì)資源，如冠縣包頭、福山包頭、唐王小根、膠縣白菜、城陽青、掖縣豬嘴、黃縣包頭等，在此基礎(chǔ)上不僅向國家種質(zhì)資源庫提供了大量原始材料，同時(shí)也培育了一批享譽(yù)國內(nèi)的優(yōu)良一代雜種，如山東、魯白以及牛牌系列大白菜一代雜種，很多品種至今仍廣受市場(chǎng)的歡迎。但是，隨著農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的惡化、新的病害（如根腫病）不斷涌現(xiàn)，再加之市場(chǎng)對(duì)大白菜品種類型的需求呈現(xiàn)個(gè)性化、專用化、周年化等趨勢(shì)，原有的很多品種越來越難以滿足市場(chǎng)的需求，急需培育適合不同栽培季節(jié)（春、夏、秋）、不同消費(fèi)需求（熟食、腌制、泡菜等）的抗病、優(yōu)質(zhì)大白菜新品種。

優(yōu)良的育種材料是培育新品種的基礎(chǔ)，近10 a來山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所大白菜課題組在廣泛調(diào)研市場(chǎng)需求動(dòng)態(tài)和生產(chǎn)中病蟲害發(fā)生特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，制定了慎密的種質(zhì)創(chuàng)新計(jì)劃。針對(duì)原有育種材料在耐抽薹性、抗根腫病等方面的不足，通過廣泛收集和引進(jìn)抗源材料，集成了回交轉(zhuǎn)育、游離小孢子培養(yǎng)和分子標(biāo)記輔助選擇等高效育種手段，系統(tǒng)改良了一批老材料，創(chuàng)制了一批新的育種材料。對(duì)育種材料的身份進(jìn)行鑒定有利于材料的保存、評(píng)價(jià)和利用。植物材料鑒定的常用方法是利用形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，但應(yīng)用此方法不僅需要鑒定者有豐富的田間識(shí)別經(jīng)驗(yàn)、同時(shí)有些形態(tài)特征還會(huì)受栽培條件和栽培地域的影響。另外，不同的鑒定者對(duì)相同的特征也存在識(shí)別方面的差異，因此基于形態(tài)特征描述的種質(zhì)材料鑒定不利于種質(zhì)材料的保存、交流以及信息化管理，而利用分子標(biāo)記對(duì)種質(zhì)材料進(jìn)行鑒定則不受這些因素的限制。目前研究者利用SSR、RAPD、SRAP等分子標(biāo)記構(gòu)建出了大豆（唐玉娟 等，2016）、水稻（陸徐忠 等，2014）、蘋果（高源 等，2015）、梨（薛華柏 等，2018）、紅麻（鄭海燕，2010）、蘿卜（邱楊 等，2014）等農(nóng)作物的分子身份證。在上述研究中，關(guān)于分子身份證構(gòu)建過程使用標(biāo)記的數(shù)量、標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果的賦值均沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，另外用于分子身份證構(gòu)建的標(biāo)記只能鑒定少量的植物材料，如果再增加或發(fā)現(xiàn)新的植物材料，還需要再開發(fā)新的標(biāo)記才能構(gòu)建新材料的分子身份證，即已經(jīng)開發(fā)的標(biāo)記兼容性不足。為了解決上述問題，本試驗(yàn)在前期工作積累的基礎(chǔ)上，從每條染色體上選擇2個(gè)InDel標(biāo)記，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)105份大白菜育種材料進(jìn)行鑒定。采用二進(jìn)制數(shù)據(jù)為標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果賦值、結(jié)合標(biāo)記缺失和加倍等特殊情況下的字母賦值結(jié)果，構(gòu)建這些材料的分子身份證。本試驗(yàn)所選InDel標(biāo)記可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果賦值的標(biāo)準(zhǔn)化、所選標(biāo)記數(shù)量也足以滿足大白菜新增資源分子身份證的構(gòu)建。試驗(yàn)結(jié)果可以為大白菜分子身份證的標(biāo)準(zhǔn)化管理和信息化管理提供借鑒，構(gòu)建的105份育種材料的分子身份證可以為大白菜育種材料鑒定、育成品種的鑒定提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所大白菜課題組收集和創(chuàng)制的育種材料105份（表1），主要包括本課題組自20世紀(jì)70年代以來從國內(nèi)收集的地方品種的優(yōu)良自交后代、部分優(yōu)良品種的親本材料以及近10 a來利用收集的優(yōu)良品種自交純化、回交轉(zhuǎn)育的純系。

試驗(yàn)于2017年春季在國家蔬菜改良中心山東分中心和山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，每份材料分別取10～20粒種子，直播于10 cm×10 cm的花盆內(nèi)，待出苗后取真葉液氮速凍，置于超低溫冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

DNA提取參考劉栓桃等（2014）的方法，即取約100 mg冷凍保存的真葉組織置于2 mL螺口研磨管中，加入800 μL 65 ℃預(yù)熱的TPS試劑（100 mmol·L-1Tris-HCl，1 mol·L-1KCl，10 mmol·L-1EDTA，200 mg·L-1RNA酶，pH=8.0）和3～4粒直徑5 mm的陶瓷研磨珠，于自動(dòng)研磨儀（法國，Precellys24）上5 000 r·min-1振蕩研磨30 s；勻漿于65 ℃溫箱或水浴鍋內(nèi)保溫30 min；待勻漿涼至室溫后10 000 r·min-1離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，加入等體積氯仿并小心混勻，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min；將上清液再次轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，并加入等體積異丙醇小心混勻，室溫下使DNA沉淀5 min；于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，棄上清液；加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，7 500 r·min-1離心1 min，棄上清液后于室溫短暫干燥DNA；加入100 μL 10 mmol·L-1Tris-HCl（pH=8.0），4 ℃過夜以溶解基因組DNA；第2天取出，3 000 r·min-1離心1 min后將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。利用UltroSpec 3300 pro（GE Healthcare）分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，將基因組DNA濃度稀釋至50 ng·μL-1，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選與合成

從前期鑒定的593對(duì)InDel標(biāo)記中進(jìn)行引物篩選（張志剛 等，2016），選擇標(biāo)準(zhǔn)在參考劉栓桃等（2018）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考慮下列因素：① 每條染色體上各選2對(duì)引物，且2對(duì)引物盡可能位于染色體的不同臂上；② 每對(duì)引物所能檢測(cè)到的等位基因頻率為2、即最多可以擴(kuò)增出2條條帶；③所選引物盡可能從90%以上的材料中都能擴(kuò)增出條帶；④ 引物所能檢測(cè)到的主要等位基因頻率介于0.5～0.8之間。基于上述標(biāo)準(zhǔn)，所選引物編號(hào)及序列如表2所示，引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

PCR擴(kuò)增采用天根生物科技（北京）有限公司 的 2×Taq Plus PCR MasterMix（KT205-01），25 μL反應(yīng)體系為：2×Taq Plus PCR MasterMix 12.5 μL，10 pmol正、反向引物各1 μL，模板（50 ng·μL-1）1 μL，去離子水9.5 μL。PCR擴(kuò)增在Bio-Rad T100TM梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司生產(chǎn)）上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94℃變性10 s，58.5 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，35次循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，以50 bp ladder作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，銀染顯色，智能手機(jī)拍照。

表1 供試大白菜材料的主要特征

表2 引物信息

1.5 數(shù)據(jù)處理

將電泳圖譜的照片在UVP GelDot IT300凝膠成像儀上轉(zhuǎn)換成tif格式，利用Vision Works LS軟件將100～200 bp范圍內(nèi)清晰可見的條帶按照下列方法賦值：如果某樣本擴(kuò)增產(chǎn)物為單一的相對(duì)遷移率較大的條帶則賦值0，單一的相對(duì)遷移率較小的條帶則賦值1。對(duì)于擴(kuò)增結(jié)果為缺失或雜合現(xiàn)象的樣品，取10個(gè)單株材料分別提取DNA進(jìn)行校準(zhǔn)，只有10個(gè)單株都為缺失或雜合型的才確定其基因型為缺失型（w）或加倍型（H），否則以高代自交系的單一擴(kuò)增結(jié)果為準(zhǔn)。

1.6 分子身份證構(gòu)建

在Excel中，將表2所列的引物按照從A01～A10的順序，從左到右排列，相同染色體上的引物則依據(jù)重測(cè)序檢測(cè)的物理位置順序從小到大排列。按照1.5的賦值方法對(duì)所有材料的20對(duì)引物檢測(cè)結(jié)果賦值，構(gòu)建原始數(shù)據(jù)矩陣。將某材料檢測(cè)結(jié)果賦值的20位數(shù)碼按順序合并在一個(gè)單元格內(nèi)，構(gòu)建育種材料的分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 核心引物的擴(kuò)增結(jié)果

圖1 引物A0402和A0501在部分大白菜材料中的擴(kuò)增結(jié)果

20對(duì)InDel引物從105份參試大白菜材料中共擴(kuò)增出40個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，每對(duì)引物都按照預(yù)期擴(kuò)增出了2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。其中有16對(duì)引物從供試105份材料中均分別擴(kuò)增出了單一條帶。經(jīng)過校準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)有2對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物存在缺失現(xiàn)象，即沒有任何條帶被擴(kuò)增，這2對(duì)引物分別是A0402和A0901，前者從11份材料中缺失、后者從7份材料中缺失；同時(shí)有2對(duì)引物（A0501和A0701）的檢測(cè)結(jié)果呈加倍現(xiàn)象，即同時(shí)擴(kuò)增出2條條帶，分別有10份和11份材料發(fā)生加倍，A0402和A0501在部分材料中的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.2 大白菜育種材料分子身份證構(gòu)建

參試105份大白菜材料的分子身份證見表3，該身份證由20位數(shù)碼組成，將所有數(shù)據(jù)在Excel表格中進(jìn)行排序，沒有發(fā)現(xiàn)重復(fù)數(shù)據(jù)。如果去掉有缺失和加倍現(xiàn)象的4個(gè)標(biāo)記，則所得的16位二進(jìn)制數(shù)碼也沒有發(fā)現(xiàn)完全相同的數(shù)據(jù)。

表3 參試105份大白菜材料的分子身份證

3 結(jié)論與討論

植物的分子身份證技術(shù)是隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的一種分子鑒定技術(shù)，主要是因?yàn)榉肿訕?biāo)記檢測(cè)不受環(huán)境條件、表型、植物組織、生長發(fā)育階段等的影響，為準(zhǔn)確、可靠地鑒定植物品種的首選手段之一，同時(shí)對(duì)品種權(quán)保護(hù)也具有重要的意義（胡振幫 等，2016）。分子身份證構(gòu)建一般遵循簡(jiǎn)約性和唯一性原則，它由一組數(shù)碼（數(shù)字或數(shù)字與字母組合）按順序排列而成，這就涉及對(duì)分子標(biāo)記檢測(cè)產(chǎn)物編碼賦值的問題。由于分子標(biāo)記的種類比較多，各物種分子標(biāo)記開發(fā)的程度不同，導(dǎo)致植物分子身份證構(gòu)建時(shí)對(duì)標(biāo)記的編碼規(guī)則和數(shù)碼長短沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因而難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、信息化管理。如辜大川等（2012）采用24對(duì)SSR引物構(gòu)建的水稻分子身份證包含85位二進(jìn)制數(shù)值或25～26位十進(jìn)制數(shù)值。同樣是水稻，陸徐忠等（2014）則利用12個(gè)水稻SSR標(biāo)記（每條染色體1個(gè)），將SSR擴(kuò)增的DNA指紋、水稻品種的基本商品信息和特異基因信息等3部分內(nèi)容考慮在內(nèi)，構(gòu)建的水稻品種分子身份證包含40位數(shù)碼（數(shù)字和字母組合）。以大豆為例，丁俊杰等（2012）構(gòu)建的大豆分子身份證包含7位十進(jìn)制數(shù)據(jù)，而唐玉娟等（2016）構(gòu)建的大豆分子身份證包含5位十進(jìn)制數(shù)據(jù)。類似的現(xiàn)象不勝枚舉，主要原因有以下幾個(gè)方面：首先是針對(duì)不同的材料篩選到的可用標(biāo)記不同，其次是對(duì)標(biāo)記的賦值方式不同（有的研究者用0、1等二進(jìn)制數(shù)據(jù)賦值，有的研究者根據(jù)多態(tài)性條帶的數(shù)目以0～9十進(jìn)制數(shù)據(jù)賦值），第三是對(duì)數(shù)碼型身份證的位數(shù)沒有統(tǒng)一規(guī)定，第四是所用標(biāo)記沒有考慮對(duì)同一物種不同品種或品系的兼容性。這就導(dǎo)致同一物種不同的實(shí)驗(yàn)室可能給出不同的身份證編碼，或者在增加新的品種或品系時(shí)，構(gòu)建其分子身份證時(shí)還需要再開發(fā)新的標(biāo)記。前者違背了“身份證”這一概念中有關(guān)唯一性的宗旨，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)難以比較和共享；后者在一定程度上限制了這項(xiàng)技術(shù)的推廣和應(yīng)用。

在構(gòu)建植物分子身份證的探索研究中，標(biāo)記的選擇至關(guān)重要。早期的研究者多使用SSR標(biāo)記（陸徐忠 等，2014；唐玉娟 等，2016；徐安然 等，2017；萬映伶，2018；薛華柏 等，2018），但SSR標(biāo)記的多態(tài)性過于豐富，它在一定數(shù)量的物種群體內(nèi)產(chǎn)生的多態(tài)性位點(diǎn)遠(yuǎn)大于2，如李國強(qiáng)（2008）和楊金雪（2013）用SSR標(biāo)記檢測(cè)大白菜種質(zhì)資源，最多的1對(duì)引物有10～12個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均則可以產(chǎn)生4.00～5.16個(gè)。用于水稻（辜大川等，2012；陸徐忠 等，2014）、大豆（丁俊杰 等，2012；唐玉娟 等，2016）等植物品種或資源分子身份證構(gòu)建的SSR標(biāo)記所產(chǎn)生的多態(tài)性位點(diǎn)也遠(yuǎn)大于2個(gè)。欲使植物分子身份證構(gòu)建技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，有必要開發(fā)新型的便于標(biāo)準(zhǔn)化賦值的分子標(biāo)記。而基于全基因組重測(cè)序技術(shù)所開發(fā)的InDel標(biāo)記可以滿足上述需求。InDel標(biāo)記的開發(fā)過程完全基于全基因組重測(cè)序發(fā)現(xiàn)的序列差異，與其他分子標(biāo)記相比，基因組同一位點(diǎn)發(fā)生不同長度大小InDel突變的幾率較小，已有研究證明多數(shù)InDel標(biāo)記僅產(chǎn)生2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，超過2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的InDel標(biāo)記在基因組中占比較少（朱東旭 等，2014；魏利斌 等，2017；劉栓桃 等，2018）。由于InDel標(biāo)記的開發(fā)完全基于測(cè)序信息，就1對(duì)引物而言，其產(chǎn)生的2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)序列和長短完全是已知的，有利于標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化賦值。

本試驗(yàn)從大白菜基因組的10條染色體上各選2對(duì)（每個(gè)染色體臂上各包含1對(duì)）反復(fù)驗(yàn)證的InDel標(biāo)記引物（張志剛 等，2016；劉栓桃 等，2017，2018），每對(duì)標(biāo)記引物在大白菜材料中僅能檢測(cè)出2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（劉栓桃 等，2018），因此便于采用二進(jìn)制數(shù)據(jù)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行賦值，對(duì)于缺失和加倍型則用字母賦值，構(gòu)建了105份大白菜材料的分子身份證，該身份證包含20位數(shù)碼。在所選的20對(duì)引物中，有16對(duì)引物從大白菜育種材料中均分別擴(kuò)增出了單一的條帶，表明這些標(biāo)記在大白菜自交系中具有唯一呈現(xiàn)性特點(diǎn)。另外，有2對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物從少數(shù)材料中缺失，這可能是相應(yīng)標(biāo)記所在的染色體片段缺失所致；同時(shí)，也有2對(duì)引物在少數(shù)材料中呈共顯性特點(diǎn)，這種共顯性呈現(xiàn)的標(biāo)記亦可能是所在的染色體片段局部加倍造成的，因?yàn)槿旧w片段的局部缺失或加倍現(xiàn)象是遺傳變異的一種常見現(xiàn)象（Cheng et al.，2013）。因?yàn)槿笔秃图颖缎偷臉?biāo)記必須經(jīng)過單株驗(yàn)證才能確定標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果，這使得相應(yīng)材料的分子身份證構(gòu)建過程更加復(fù)雜、成本也相應(yīng)地增加，所以在今后的工作中，應(yīng)在上述缺失型和加倍型標(biāo)記所在的染色體區(qū)域再篩選和開發(fā)具有唯一呈現(xiàn)性的標(biāo)記引物，對(duì)大白菜分子身份證進(jìn)行修正，這樣得到的大白菜分子身份證將都是二進(jìn)制數(shù)碼，便于利用計(jì)算機(jī)對(duì)分子身份證數(shù)據(jù)庫進(jìn)行管理。但就本試驗(yàn)而言，即使淘汰這4對(duì)引物，產(chǎn)生的16位二進(jìn)制數(shù)碼也足以將105份材料完全區(qū)分開。另外，本試驗(yàn)篩選的20對(duì)引物具有較強(qiáng)的兼容性，因?yàn)槔碚撋现v20對(duì)標(biāo)記所能容納的分子身份證數(shù)量將是220，即可以鑒定1 048 576份大白菜材料，因此這些標(biāo)記引物的開發(fā)對(duì)新創(chuàng)制材料分子身份證構(gòu)建具有通用性，有利于更多大白菜種質(zhì)資源分子身份證的構(gòu)建，同時(shí)也適用于雜交種分子身份證構(gòu)建，從而為品種權(quán)維權(quán)提供技術(shù)鑒定依據(jù)。

綜上所述，本試驗(yàn)篩選到的僅能擴(kuò)增出2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的InDel標(biāo)記有利于分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果的賦值標(biāo)準(zhǔn)化，不僅適合現(xiàn)有大白菜育種材料的分子身份證構(gòu)建，同時(shí)也適合更多大白菜新種質(zhì)以及大白菜雜交種的分子身份證構(gòu)建。旨在為植物分子身份證技術(shù)的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化管理提供參考和借鑒，為大白菜品種權(quán)維權(quán)提供技術(shù)鑒定依據(jù)。