段騰飛，李 昭，岳田利，夏秋霞，孟江洪

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反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃貯藏過(guò)程擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)的抑制作用

段騰飛1,2，李 昭1，岳田利1※，夏秋霞1，孟江洪1

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，楊凌 712100；2.宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，宿州 234000）

為研究反式-2-己烯醛對(duì)擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)及展青霉素產(chǎn)生的抑制作用。選取反式-2-己烯醛和研究報(bào)道的8種具有抑菌效果的物質(zhì)對(duì)5株擴(kuò)展青霉進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，研究反式-2-己烯醛的抑菌效果并測(cè)定其最小抑菌濃度，然后進(jìn)行獼猴桃活體試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定硬度、可溶性固形物、可滴定酸、維生素C、pH值等指標(biāo)研究反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃品質(zhì)的影響，并采用高效液相檢測(cè)抑菌試驗(yàn)前后獼猴桃活體中展青霉素含量，最終通過(guò)掃面電子顯微鏡觀察反式-2-己烯醛對(duì)5株擴(kuò)展青霉形態(tài)的影響。結(jié)果反式-2-己烯醛與8種抑菌物質(zhì)相比，反式-2-己烯醛抑菌效果最好，能夠完全抑制5株擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)且得到對(duì)5株試驗(yàn)菌的最小抑菌濃度（MIC，minimum inhibitory concentration）；反式-2-己烯醛能夠極顯著降低擴(kuò)展青霉對(duì)獼猴桃果實(shí)硬度、可滴定酸、維生素C的的影響（<0.01），并且對(duì)獼猴桃硬度、可溶性固形物、pH值和還原糖及維生素C含量等沒(méi)有極顯著影響（>0.01），極顯著降低了染菌獼猴桃果實(shí)的腐爛率（<0.01），較好的保持了獼猴桃品質(zhì)，經(jīng)反式-2-己烯醛處理的染菌獼猴桃均沒(méi)有展青霉素檢出；掃面電子顯微鏡顯示5株試驗(yàn)菌出現(xiàn)菌絲皺縮、折疊、干癟，孢子生成減少現(xiàn)象。研究反式-2-己烯醛對(duì)擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)及展青霉素產(chǎn)生均具有很好的抑制作用，可為開(kāi)發(fā)具有抑菌作用可替代農(nóng)藥的天然產(chǎn)物提供理論基礎(chǔ)。

果實(shí)；菌；貯藏；反式-2-己烯醛；擴(kuò)展青霉；抑菌效果；獼猴桃；展青霉素

0 引 言

擴(kuò)展青霉是一種引起獼猴桃、蘋(píng)果、梨等水果腐敗變質(zhì)的常見(jiàn)霉菌，并且許多擴(kuò)展青霉在侵染水果及其制品的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生展青霉素（patulin）。展青霉素又稱棒曲霉素，是一種主要由青霉屬（）和曲霉屬（）產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-2]，具有致癌、致畸、致突變和廣泛的生理及細(xì)胞毒性[3]，當(dāng)人體攝入過(guò)量展青霉素時(shí)，會(huì)出現(xiàn)惡心、抽搐、呼吸困難、甚至?xí)炟实纫幌盗械募毙院吐圆“Y[4-5]。

獼猴桃（）又稱“奇異果”，含有豐富的氨基酸、維生素、膳食纖維及多酚類(lèi)化合物，具有顯著的生物活性和抗氧化能力，由于其果肉鮮美，口感酸甜，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受大眾的喜愛(ài)[6-7]。中國(guó)是獼猴桃發(fā)源地，并且是世界上獼猴桃最大生產(chǎn)國(guó)，其中陜西地區(qū)分布最多[8]，獼猴桃在成熟后期果實(shí)逐漸變軟、果皮較薄，因此在采摘、加工、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中容易感染擴(kuò)展青霉，產(chǎn)生展青霉素且展青霉素會(huì)在果實(shí)內(nèi)遷移，加速獼猴桃的腐敗變質(zhì)，不僅造成人力和財(cái)力浪費(fèi)，還對(duì)人體健康造成危害[9]。因此研究一種安全、有效的方法控制獼猴桃及其制品霉變和展青霉素積累變得十分必要，也是保證獼猴桃及果汁產(chǎn)業(yè)快速、健康發(fā)展的核心問(wèn)題之一。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)食品中展青霉素的控制主要通過(guò)物理、化學(xué)和生物方法直接去除食品中的展青霉素或者殺滅展青霉素產(chǎn)生菌，從源頭上控制展青霉素的產(chǎn)生，目前研究較多的物理方法主要采用吸附[10]、紫外線輻照[11-12]、超聲波[13]、分子印跡技術(shù)[14-15]、低溫等離子體[16]等，該方法操作簡(jiǎn)單，但對(duì)于水果及其制品品質(zhì)影響和廣泛應(yīng)用仍需進(jìn)一步探索?；瘜W(xué)方法主要采用殺菌劑[17]、臭氧[18]、果汁護(hù)色劑[19]等抑制擴(kuò)展青霉的生長(zhǎng)，操作方便，但是長(zhǎng)期使用會(huì)增強(qiáng)病原菌抗藥性，同時(shí)會(huì)造成環(huán)境污染，威脅人類(lèi)健康。生物方法主要采用微生物（酵母菌[20-21]、乳酸菌[22]芽孢桿菌[23]等）抑菌和天然產(chǎn)物（生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、精油類(lèi)等）抑菌[24-27]。天然產(chǎn)物多是存在于植物中的生物活性物質(zhì)，來(lái)源廣泛，成本低，抑菌效果顯著，同時(shí)能夠很好的保持食品中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有很大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

本試驗(yàn)比較了反式-2-己烯醛和文獻(xiàn)研究報(bào)道的8種具有抑菌作用的檸檬酸、檸檬烯、蘋(píng)果酸、-氨基丁酸、槲皮素、兒茶素、雙乙酸鈉、草酸[28-32]對(duì)5株擴(kuò)展青霉的體外抑菌效果，并測(cè)定反式-2-己烯醛最小抑菌濃度（MIC）及其對(duì)獼猴桃理化指標(biāo)（硬度、可溶性固形物、還原糖、可滴定酸、pH值、維生素C）的影響，最終通過(guò)測(cè)定染菌獼猴桃中展青霉素含量和掃面電子顯微鏡觀察，研究反式-2-己烯醛對(duì)擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)及展青霉素生成的抑制作用，以期得到一種天然、安全、有效的抑菌產(chǎn)物抑制擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)及毒素積累。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：CICC40658、CGMCC3.3703購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，為擴(kuò)展青霉標(biāo)準(zhǔn)菌株；LPH6、LPH5為實(shí)驗(yàn)室分離菌株，分離于蘋(píng)果；WY為實(shí)驗(yàn)室分離菌株，分離于獼猴桃。

獼猴桃品種為秦美（Qinmei）購(gòu)自楊凌陽(yáng)光超市；展青霉素標(biāo)品純度為99%以上，購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。檸檬酸、檸檬烯、蘋(píng)果酸、-氨基丁酸、槲皮素、兒茶素、雙乙酸鈉、草酸、反式-2-己烯醛純度均為98%以上，購(gòu)于阿拉丁有限公司。

購(gòu)自陜西楊凌陽(yáng)光超市。氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞、次氯酸鈉硫酸銅、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸乙酯、乙酸、鹽酸等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，蒸餾水1 000 mL，煮沸20 min至馬鈴薯切塊變軟，過(guò)濾并定容至1 000 mL，再加入葡萄糖20 g、瓊脂20 g。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）：PDA培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.2 材料與設(shè)備

LC-2010ATH高效液相色譜，日本島津有限公司；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DK-98-II恒溫水浴鍋，天津市亞泰斯儀器有限公司；UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；雷磁 PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；WYT-4型阿貝折射儀，泉州中友光學(xué)儀器有限公司；GY-4 型數(shù)顯硬度計(jì)，浙江托普儀器有限公司；鍍鉻游標(biāo)卡尺，寶雞市量具有限公司；SC-3610低溫離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 9種抑菌物質(zhì)對(duì)擴(kuò)展青霉抑制作用

1）孢子懸液制備

取4 ℃保存的5株擴(kuò)展青霉CICC40658、CGMCC3.3703、LPH6、LPH5、WY，分別接種到100 mL PDB培養(yǎng)基中活化，28 ℃培養(yǎng)5 d，劃線法轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d后，用無(wú)菌水沖洗PDA斜面培養(yǎng)基制成孢子濃度為1.0×106cfu/mL孢子懸液。

2）菌餅制備

取100L（濃度為1.0×106cfu/mL）5株擴(kuò)展青霉孢子懸液，接種至PDA培養(yǎng)皿，28℃培養(yǎng)48 h。用200L移液槍槍頭尾部在菌株培養(yǎng)基上打孔，并用注射器針頭挑取制成菌餅，試驗(yàn)均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

3）9種抑菌物質(zhì)體外抑菌試驗(yàn)

制備10組PDA培養(yǎng)基，每組300 mL，滅菌待冷卻至50 ℃時(shí)每組分別加入一定量的檸檬酸、檸檬烯、蘋(píng)果酸、-氨基丁酸、槲皮素、兒茶素、雙乙酸鈉、草酸、反式-2-己烯醛，使抑菌物質(zhì)濃度為5 mg/mL，同時(shí)加入15 mg吐溫80助溶混合均勻，迅速倒于培養(yǎng)皿中冷卻。將制得的CICC40658、CGMCC3.3703、LPH6、LPH5、WY菌餅分別接種于含有抑菌物質(zhì)的PDA培養(yǎng)基平皿中。設(shè)置空白對(duì)照，每組平行3次。

4）菌落直徑的測(cè)定

將接種有菌餅的含有抑菌物質(zhì)的PDA培養(yǎng)皿置于28 ℃恒溫箱避光培養(yǎng)5 d，每天同一時(shí)刻采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每組平行3次。

5）稀釋后草酸和反式-2-己烯醛對(duì)擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)的影響

為進(jìn)一步研究草酸和反式-2-己烯醛對(duì)擴(kuò)展青霉的抑制效果，將一定量的草酸和反式-2-己烯醛分別加入PDB培養(yǎng)基進(jìn)行等濃度梯度稀釋，使其濃度分別為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/mL，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察是否有菌絲生成，并用劃線法轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)皿中，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察是否有菌落形成。

1.3.2 反式-2-己烯醛最小抑菌濃度測(cè)定

制備5組PDA培養(yǎng)基，每組300 mL，滅菌待冷卻至50 ℃時(shí)加入一定量反式-2-己烯醛（MIC, minimum inhibitory concentration），使其濃度依次為40、60、80、100L/L，將制得的CICC40658、CGMCC3.3703、LPH6、LPH5、WY菌餅分別接種于含有抑菌物質(zhì)的PDA培養(yǎng)皿中，28 ℃培養(yǎng)12 d，從第2天開(kāi)始，每天同一時(shí)間采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。設(shè)置空白對(duì)照，每組平行3次。

1.3.3 反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃品質(zhì)的影響

1）獼猴桃活體試驗(yàn)

挑選大小、硬度相近、無(wú)病害的新鮮獼猴桃果實(shí)，用1% NaClO溶液浸泡2 min，無(wú)菌水沖洗干凈，置于無(wú)菌操作臺(tái)中晾干待用。然后用直徑3 mm的無(wú)菌鐵釘在獼猴桃赤道部位打孔，孔深5 mm，用移液槍分別取10L、1.0×106cfu/mL 5株試驗(yàn)菌的孢子懸液注入孔中侵染獼猴桃，經(jīng)添加反式-2-己烯醛100L/L的為處理組（S），未添加反式-2-己烯醛的染菌獼猴桃為未處理組（T），未染菌和反式-2-己烯醛處理的獼猴桃為空白組，每組10個(gè)獼猴桃計(jì)算獼猴桃腐爛率，將試驗(yàn)獼猴桃置于保鮮袋中28 ℃培養(yǎng)7 d。

2）樣品制備

在試驗(yàn)獼猴桃打孔附近0.5～2 cm取15 g均勻試樣（精確到0.01 g）置于100 mL離心管中，漩渦震蕩5 min，10 000 r/min，離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液于50 mL離心管中，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3）指標(biāo)測(cè)定

硬度的測(cè)定：GY-4 型數(shù)顯硬度計(jì)直接測(cè)定；可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）的測(cè)定：采用阿貝折射儀測(cè)定；pH值的測(cè)定：采用pH計(jì)直接測(cè)定；還原糖含量測(cè)定：采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定，結(jié)果以葡萄糖含量計(jì)；可滴定酸測(cè)定：采用酸堿滴定法測(cè)定。維生素C含量測(cè)定：采用2,6-二氯靛酚法，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用實(shí)驗(yàn)方法》。每個(gè)理化指標(biāo)測(cè)定3次。

1.3.4 反式-2-己烯醛對(duì)展青霉素產(chǎn)生的影響

1）展青霉素提取與測(cè)定

在試驗(yàn)獼猴桃打孔附近0.5～2 cm取10 g均勻試樣（精確到0.01 g）于100 mL離心管中，加入20 mL無(wú)菌水，勻漿1 min，然后加入150L果膠酶溶液混合均勻，置于40 ℃水浴鍋中水浴2 h，用20 mL乙酸乙酯重復(fù)提取兩次，萃取上清液。水浴中減壓濃縮至干，用1.5 mL pH值為4水溶液（乙酸調(diào)節(jié)）溶解殘?jiān)?jīng)0.22m濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜測(cè)定。

2）色譜條件

采用Eclipse Plus C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5m），流動(dòng)相為乙腈-水體積比（10∶90），梯度洗脫。流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：20L，檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm。

1.3.5 反式-2-己烯醛對(duì)擴(kuò)展青霉菌體及孢子生成的影響

通過(guò)掃面電子顯微鏡觀察反式-2-己烯醛對(duì)擴(kuò)展青霉菌絲形態(tài)和孢子生成數(shù)量的影響。將制得的CICC40658、CGMCC3.3703、LPH6、LPH5、WY菌餅分別接種于反式-2-己烯醛濃度為40L/L的PDA培養(yǎng)皿中，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。設(shè)置空白對(duì)照，每組平行3次。取試驗(yàn)組和空白組樣品在4 000 r/min下離心6 min，棄掉上清液，加入1 mL 4%戊二醛固定液4℃下固定2 h。然后用0.1 mol/L pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行漂洗，5、10、15、20、25、30 min時(shí)各漂洗一次。再用1%鋨酸常溫固定2 h，重復(fù)上述磷酸鹽緩沖液漂洗之后分別用30%、50%、70%、80%、90%乙醇進(jìn)行梯度脫水。最后經(jīng)真空冷凍干燥，噴金后進(jìn)行場(chǎng)發(fā)射掃面電鏡觀察，并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin9.0軟件做圖，SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，分析顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 9種抑菌物質(zhì)對(duì)展青霉體外抑菌效果

試驗(yàn)選取反式-2-己烯醛和文獻(xiàn)研究報(bào)道的8種具有抑菌作用的物質(zhì)(質(zhì)量濃度均為5 mg/mL)對(duì)5株擴(kuò)展青霉菌株進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果如表1。

表1 9種抑菌物質(zhì)對(duì)擴(kuò)展青霉菌生長(zhǎng)的影響

注：同一行相同字母代表不同天然抑菌物質(zhì)對(duì)相應(yīng)菌株的抑菌效果在<0.01水平上沒(méi)有極顯著差異, CICC40658和CGMCC3.3703為擴(kuò)展青霉標(biāo)準(zhǔn)菌株；LPH6、LPH5和WY為實(shí)驗(yàn)室分離菌株,下同。

Note: Same letter on the same line means that the antibacterial effect of different natural antibacterial substances on the corresponding strains was not significantly different at<0.01 level. CICC40658 and CGMCC3.3703 are standard strains for; LPH6, LPH5 and WY are laboratory isolates, the same below.

與空白組相比，48和96 h時(shí)，槲皮素和兒茶素對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌CICC40658沒(méi)有顯著抑制作用（0.01），120 h時(shí)，9種天然抑菌物質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌CICC40658均具有極顯著抑制作用（0.01），且抑菌效果從大到小依次為：反-2-己烯醛＞草酸＞雙乙酸鈉＞兒茶素＞檸檬酸＞-氨基丁酸＞蘋(píng)果酸＞槲皮素＞檸檬烯；48 h時(shí)，檸檬酸和-氨基丁酸對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌CGMCC3.37038具有極顯著促進(jìn)作用（0.01），120 h時(shí)，8種天然抑菌物質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌CGMCC3.3703具有極顯著抑制作用（0.01），且抑菌效果從大到小依次為：反-2-己烯醛＞草酸＞雙乙酸鈉＞兒茶素＞蘋(píng)果酸＞-氨基丁酸＞槲皮素＞檸檬酸，其中檸檬烯對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌CGMCC3.3703生長(zhǎng)出現(xiàn)顯著促進(jìn)作用（0.01），菌落直徑從3.39增長(zhǎng)到3.56 cm；在48、72、96和120 h時(shí)，兒茶素和-氨基丁酸對(duì)分離菌LPH5生長(zhǎng)均出現(xiàn)顯著促進(jìn)作用（0.01），120 h時(shí)，4種天然物質(zhì)對(duì)分離菌LPH5具有極顯著抑制作用（0.01），且抑菌效果從大到小依次為：反-2-己烯醛＞草酸＞雙乙酸鈉＞檸檬酸，其中蘋(píng)果酸和檸檬烯對(duì)分離菌LPH5沒(méi)有顯著抑制作用（0.01）；在48、96和120 h時(shí)，雙乙酸鈉和-氨基丁酸對(duì)分離菌LPH6生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用（0.01），120 h時(shí)，7種天然物質(zhì)對(duì)分離菌LPH6具有顯著抑制作用（0.01），且抑菌效果從大到小依次為：草酸＞反-2-己烯醛＞兒茶素＞檸檬烯＞檸檬酸＞蘋(píng)果酸＞槲皮素；在48、72、96和120 h時(shí)，5種天然物質(zhì)對(duì)分離菌WY具有顯著抑制作用（0.01），120 h時(shí)抑菌效果從大到小依次為：草酸＞反-2-己烯醛＞雙乙酸鈉＞檸檬酸＞蘋(píng)果酸，其中4種天然物質(zhì)對(duì)分離菌WY具有顯著促進(jìn)作用（0.01），促進(jìn)效果從大到小依次為：-氨基丁酸＞槲皮素＞檸檬烯＞兒茶素。綜上所述，9種天然物質(zhì)中反-2-己烯醛和草酸在48、72、96和120 h均對(duì)5株擴(kuò)展青霉菌株具有顯著抑制作用，且抑菌效果較好。

稀釋后草酸和反式-2-己烯醛的抑菌效果如表2所示：草酸在稀釋不同倍數(shù)后，濃度低于1.25 mg/mL時(shí)，抑菌效果降低，28 ℃培養(yǎng)5 d，PDB培養(yǎng)基變渾濁，5株試驗(yàn)菌均有菌絲產(chǎn)生，PDA培養(yǎng)皿均有菌落檢出，這可能是由于草酸稀釋后氫離子濃度降低抑菌效果受pH影響引起的[31]；而反式-2-己烯醛在稀釋濃度為0.312 5 mg/mL時(shí)，仍對(duì)5株試驗(yàn)菌具有很好的抑制作用，28 ℃培養(yǎng)5 d，PAB培養(yǎng)基保持澄清，5株菌均未出現(xiàn)菌絲，PAD培養(yǎng)皿均未有菌落檢出。因此后續(xù)試驗(yàn)選擇反式-2-己烯醛為最佳抑菌物質(zhì)進(jìn)行研究。

表2 不同質(zhì)量濃度天然抑菌物質(zhì)對(duì)擴(kuò)展青霉菌生長(zhǎng)的影響

注：“+”代表PDB、PDA培養(yǎng)基有菌絲產(chǎn)生、培養(yǎng)基有菌落生長(zhǎng)；“-”代表PDB、PDA培養(yǎng)基沒(méi)有菌落生長(zhǎng)。

Note: “+” represents hyphae production in PDB and PDA medium; “-” represents no hyphae production in PDB and PDA medium.

2.2 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定結(jié)果

由表3可知：反式-2-己烯醛對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌CICC40658和CGMCC3.3703、分離菌LPH5、LPH6和WY的最小抑菌濃度（MIC）依次為100、80、80、80、80L/L，當(dāng)反式-2-己烯醛濃度為100L/L時(shí)均未檢測(cè)到菌生長(zhǎng)。當(dāng)反式-2-己烯醛濃度為40L/L、培養(yǎng)12 d時(shí)，抑菌率依次為0.18%、6.81%、3.30%、40.38%、2.96%，5株試驗(yàn)菌對(duì)反式-2-己烯醛敏感程度從大到小依次為L(zhǎng)PH6＞CGMCC3.3703＞LPH5＞W(wǎng)Y＞CICC40658；當(dāng)反式-2-己烯醛濃度為60μL·L-1、培養(yǎng)12天時(shí)，抑菌率依次為3.87%、9.44%、24.18%、58.68%、6.25%，5株試驗(yàn)菌對(duì)反式-2-己烯醛敏感程度從大到小依次為L(zhǎng)PH6＞LPH5＞CGMCC3.3703＞W(wǎng)Y＞CICC40658。當(dāng)反式-2-己烯醛體積濃度分別為40和60L/L，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，抑菌效果有所降低，當(dāng)反式-2-己烯醛濃度為40L/L，與空白組相比，培養(yǎng)時(shí)間在第11和第12天時(shí)，反式-2-己烯醛對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌CICC40658沒(méi)有極顯著抑制作用（>0.01），培養(yǎng)時(shí)間在第9和第10天時(shí)，反式-2-己烯醛對(duì)分離菌LPH5沒(méi)有極顯著抑制作用（>0.01）。隨著反式-2-己烯醛濃度增加，抑菌效果增強(qiáng)，與空白組相比，相同培養(yǎng)時(shí)間下，不同濃度的反式-2-己烯醛對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌CGMCC3.3703、分離菌LPH6和WY均具有極顯著抑制作用（0.01）；當(dāng)反式-2-己烯醛濃度為60L/L時(shí)，反式-2-己烯醛對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌CICC40658和分離菌LPH5均具有極顯著抑制作用（<0.01），因此，在一定濃度下，反式-2-己烯醛對(duì)5株擴(kuò)展青霉具有顯著抑制作用（<0.01）。

表3 反式-2-己烯醛對(duì)5株試驗(yàn)菌最小抑菌濃度測(cè)定

注：“-”代表菌落未生長(zhǎng)，同一列相同字母代表不同濃度的反式-2-己烯醛對(duì)相應(yīng)菌株的抑菌效果在<0.01水平上差異極不顯著。

Note:“-” represents the colony does not grow, the same column of the same letter represents the different concentrations of trans-2-hexenal antibacterial effect on the corresponding strains at the<0.01 level of the difference is extremely insignificant.

2.3 反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃品質(zhì)的影響

反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃果實(shí)硬度的影響如表4所示：第1天，處理組、對(duì)照組獼猴桃果實(shí)硬度均沒(méi)有極顯著差異（>0.01），第7天時(shí)，獼猴桃果實(shí)硬度均是空白組＞處理組＞未處理組，其中侵染擴(kuò)展青霉LPH6的獼猴桃果實(shí)硬度降低至最初的23.80%，3組果實(shí)硬度值分別為4.12（空白組）＞4.01（處理組）＞1.88（未處理組），可能是由于擴(kuò)展青霉在獼猴桃上生長(zhǎng)，造成果實(shí)軟化變質(zhì)[9]；反式-2-己烯醛處理組獼猴桃果實(shí)硬度均大于未處理組，差異極顯著（P<0.01）說(shuō)明反式-2-己烯醛可以在一定程度上抑制擴(kuò)展青霉在獼猴桃上快速生長(zhǎng)，降低擴(kuò)展青霉對(duì)獼猴桃果實(shí)硬度的影響；與空白組相比，處理組獼猴桃果實(shí)硬度稍低，但并沒(méi)有極顯著差異（>0.01），說(shuō)明反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃果實(shí)硬度沒(méi)有顯著影響

反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃可溶性固形物（soluble solids content，SSC）含量的影響：第1天，空白組、未處理組和處理組，其中處理組與空白組的試驗(yàn)獼猴桃可溶性固形物含量（SSC）沒(méi)有極顯著差異（>0.01）；第7天，試驗(yàn)獼猴桃SSC均為空白組＞處理組＞未處理組，其中處理組與空白組獼猴桃SSC沒(méi)有極顯著差異（>0.01），說(shuō)明反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃SSC沒(méi)有極顯著影響（>0.01），而未處理組侵染獼猴桃SSC含量極顯著低于處理組（<0.01），說(shuō)明反式-2-己烯醛處理可以在一定程度上降低侵染獼猴桃可溶性固形物含量上升，抑制擴(kuò)展青霉對(duì)獼猴桃品質(zhì)的影響。與空白組相比未處理組獼猴桃果實(shí)SSC極顯著降低，其中侵染分離菌LPH6獼猴桃SSC降低6.38%，可能由于隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，擴(kuò)展青霉適應(yīng)酸性環(huán)境，在獼猴桃上快速生長(zhǎng)繁殖，消耗各種可溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；

反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃可滴定酸含量和pH值的影響：第1天，空白組、未處理組和處理組試驗(yàn)獼猴桃可滴定酸含量和pH值均沒(méi)有極顯著差異（>0.01），第7天，試驗(yàn)獼猴桃可滴定酸含量為未處理組＞處理組＞空白組，試驗(yàn)獼猴桃pH值為空白組＞處理組＞未處理組，隨著貯藏時(shí)間，空白獼猴桃可滴定酸含量持續(xù)下降和pH值上升，但變化比較緩慢分別為：26.19%和12.79%，其中未處理組獼猴桃可滴定酸含量高于空白組，且差異極顯著（<0.01），可能是由于擴(kuò)展青霉在獼猴桃上快速生長(zhǎng)，產(chǎn)生酸類(lèi)物質(zhì)；第7天，與空白組相比，處理組獼猴桃可滴定酸含量和pH值均沒(méi)有顯著差異（>0.01），說(shuō)明反式-2-己烯醛處理對(duì)獼猴桃pH值沒(méi)有極顯著影響（>0.01），并且在一定程度上可以抑制染菌獼猴桃pH值的升高；

反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃還原糖含量的影響：第1天，試驗(yàn)獼猴桃還原糖含量均沒(méi)有極顯著差異（>0.01），第7天，試驗(yàn)獼猴桃還原糖含量均空白組＞處理組＞未處理組，未處理組染菌獼猴桃還原糖含量極顯著低于空白組（<0.01），其中未處理組侵染分離菌LPH6獼猴桃還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低5.53%，處理組降低1.91%，說(shuō)明反式-2-己烯醛處理可以在一定程度上抑制染菌獼猴桃還原糖含量降低，降低擴(kuò)展青霉產(chǎn)生菌對(duì)獼猴桃品質(zhì)的影響，試驗(yàn)獼猴桃還原糖含量處理組與空白組沒(méi)有極顯著差異（>0.01），說(shuō)明反式-2-己烯醛處理對(duì)獼猴桃還原糖含量沒(méi)有顯著影響。

反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃維生素C含量的影響：第1天，試驗(yàn)獼猴桃維生素含量均沒(méi)有極顯著差異（>0.01），第7天，試驗(yàn)獼猴桃維生素含量為空白組＞處理組＞未處理組，隨著貯藏時(shí)間，空白獼猴桃維生素質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降14.02%，未處理組染菌獼猴桃維生素含量極顯著低于空白組（<0.01），其中未處理組侵染分離菌LPH6獼猴桃還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低33.73%，處理組降低16.62%，說(shuō)明反式-2-己烯醛處理可以在一定程度上抑制染菌獼猴桃維生素含量降低，降低擴(kuò)展青霉產(chǎn)生菌對(duì)獼猴桃品質(zhì)的影響，試驗(yàn)獼猴桃維生素含量處理組與空白組沒(méi)有極顯著差異（>0.01），說(shuō)明反式-2-己烯醛處理對(duì)獼猴桃維生素含量沒(méi)有顯著影響。

反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃果實(shí)腐爛率的影響：第1天，獼猴桃果實(shí)并未發(fā)病，果實(shí)完好，第7天，未經(jīng)反式-2-己烯醛處理的染菌獼猴桃大量腐爛，而處理組染菌獼猴桃腐爛率顯著降低未處理組，其中接種擴(kuò)展青霉LPH6獼猴桃腐爛率為98.87%，處理組腐爛率為28.31%，說(shuō)明反式-2-己烯醛對(duì)擴(kuò)展青霉有顯著抑制作用（<0.01），能夠降低染菌獼猴桃的腐敗變質(zhì)。

表4 反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃品質(zhì)的影響

注：“S”表示未加入反式-2-己烯醛處理，“T”表示加入一定濃度的反式-2-己烯醛處理。

Note: “S”means that trans-2-hexenal is not added and “T” means that a certain concentration of trans-2-hexenal is added.

2.4 反式-2-己烯醛對(duì)展青霉素生成的影響

從表5中可以看出，未用反式-2-己烯醛處理的染菌獼猴桃，除標(biāo)準(zhǔn)菌CGMCC3.3703未檢測(cè)到展青霉素外，其余四株擴(kuò)展青霉都產(chǎn)生展青霉素，且含量均高于水果原汁、原漿等半制品中展青霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)18~953g/kg），可能原因是獼猴桃果實(shí)pH值較低，適宜于擴(kuò)展青霉產(chǎn)生毒素以及毒素累積[9]。而用反式-2-己烯醛處理的染菌獼猴桃均未檢出展青霉素，說(shuō)明反式-2-己烯醛不僅對(duì)擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)具有很好抑制作用還能夠有效抑制擴(kuò)展青霉在獼猴桃上產(chǎn)生毒素與毒素累積。

表5 反式-2-己烯醛對(duì)生成展青霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.5 掃面電鏡結(jié)果

反式-2-己烯醛處理前后5株擴(kuò)展青霉的掃面電鏡結(jié)果由圖1所示：正常的分離菌LPH6菌絲生長(zhǎng)茁壯，相互間交織形成繁茂的菌絲體，菌絲體頂端產(chǎn)生多細(xì)胞的分生孢子梗，梗末端分裂成串的分生孢子，呈掃帚狀，孢子為規(guī)則橢球形，形態(tài)飽滿（圖1a），經(jīng)反式-2-己烯醛處理的分離菌LPH6 菌絲生長(zhǎng)稀疏，菌絲體明顯減少，形態(tài)雜亂，且未觀察到孢子產(chǎn)生（圖1b）；正常的分離菌LPH5菌絲光滑飽滿，形態(tài)呈規(guī)則管狀，有少量橢球形孢子產(chǎn)生，形態(tài)飽滿（圖1c），經(jīng)反式-2-己烯醛處理的分離菌LPH5菌絲出現(xiàn)明顯皺縮、干癟現(xiàn)象，形態(tài)呈條帶狀且未觀察到孢子產(chǎn)生（圖1d）；正常的標(biāo)準(zhǔn)菌CICC 40658、CGMCC 3.3703和分離菌WY菌絲生長(zhǎng)茁壯、形態(tài)呈規(guī)則管狀，表面光滑飽滿（圖1e、圖1g、圖1i），經(jīng)反式-2-己烯醛處理后3株擴(kuò)展青霉菌絲均出現(xiàn)生長(zhǎng)稀疏，菌絲形態(tài)呈條帶狀，出現(xiàn)明顯皺縮、干癟、螺旋現(xiàn)象（圖1f、圖1h、圖1j）；由上述可知，一定濃度的反式-2-己烯醛不僅影響擴(kuò)展青霉菌絲正常生長(zhǎng)，還會(huì)抑制孢子產(chǎn)生，從而影響擴(kuò)展青霉正常繁殖達(dá)到抑菌效果。

圖1 反式-2-己烯醛處理前后5株擴(kuò)展青霉的掃描電子顯微鏡圖

3 討 論

本文選擇天然存在于獼猴桃中的反式-2-己烯醛對(duì)5株擴(kuò)展青霉進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)和獼猴桃活體試驗(yàn)，首先以文獻(xiàn)報(bào)道的8種具有抑菌作用的物質(zhì)做對(duì)比，分別將5株擴(kuò)展青霉菌餅接種于含有反式-2-己烯醛和8種抑菌物質(zhì)濃度為5 mg/mL的PDA培養(yǎng)基中，進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明與8種抑菌物質(zhì)相比，反式-2-己烯醛的抑菌效果最好，但是由于離體抑菌效果與實(shí)際應(yīng)用中獼猴桃果實(shí)保鮮效果存在一定差異，因此后續(xù)試驗(yàn)可以對(duì)高溫自發(fā)氣調(diào)情況下，9種抑菌劑對(duì)獼猴桃果實(shí)保鮮效果進(jìn)行研究，確定反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃果實(shí)保鮮效果。試驗(yàn)采用直徑3 mm的無(wú)菌鐵釘在獼猴桃赤道部位打孔，接種10L、1.0×106cfu/mL 5株試驗(yàn)菌的孢子懸液的方法模擬獼猴桃感染擴(kuò)展青霉菌，通過(guò)添加濃度100L/L的反式-2-己烯醛進(jìn)行獼猴桃活體抑菌試驗(yàn)，研究反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃品質(zhì)的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明反式-2-己烯醛能夠較好保持獼猴桃的品質(zhì)，但是由于反式-2-己烯醛的抑菌效果在試驗(yàn)?zāi)M條件下和獼猴桃自然條件下感染青霉菌可能存在差異，因此需要對(duì)自然條件下侵染青霉菌的獼猴桃進(jìn)行活體試驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證反式-2-己烯醛在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)獼猴桃上擴(kuò)展青霉抑制效果及品質(zhì)的影響。試驗(yàn)通過(guò)掃面電鏡初步探索了反式-2-己烯醛的抑菌機(jī)理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反式-2-己烯醛不僅能夠使5株擴(kuò)展青霉菌絲出現(xiàn)明顯皺縮、干癟、螺旋等現(xiàn)象，還能夠抑制孢子的繁殖和展青霉素的產(chǎn)生及積累。但是對(duì)于反式-2-己烯醛引起擴(kuò)展青霉細(xì)胞死亡的原因還未完全揭示，后續(xù)試驗(yàn)可以通過(guò)測(cè)定擴(kuò)展青霉細(xì)胞膜通透性、電勢(shì)變化及作用靶點(diǎn)等進(jìn)一步研究反式-2-己烯醛的抑菌機(jī)理。

4 結(jié) 論

本文選取反式-2-己烯醛和8種文獻(xiàn)報(bào)道具有抑菌效果的物質(zhì)對(duì)5株擴(kuò)展青霉進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，研究反式-2-己烯醛的抑菌效果并測(cè)定最小抑菌濃度，通過(guò)獼猴桃活體試驗(yàn)進(jìn)一步研究了反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃品質(zhì)影響，并初步探索了抑菌機(jī)理，得到以下結(jié)論：

1）與8種文獻(xiàn)報(bào)道具有抑菌效果物質(zhì)相比，反式-2-己烯醛能夠極顯著抑制5株擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)（<0.01），具有最佳抑菌效果，反式-2-己烯醛對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌CICC40658和CGMCC3.3703、分離菌LPH5、LPH6和WY的最小抑菌濃度（MIC）依次為100、80、80、80、80L/L。

2）試驗(yàn)采用100L/L反式-2-己烯醛對(duì)感染5株擴(kuò)展青霉的獼猴桃進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反式-2-己烯醛能夠極顯著抑制染菌獼猴桃果實(shí)硬度、可滴定酸、維生素C含量的快速下降（<0.01），并且對(duì)獼猴桃果實(shí)硬度、SSC、pH值和還原糖含量均沒(méi)有極顯著影響（>0.01），較好的保持了獼猴桃的品質(zhì)。

3）高效液相法測(cè)定獼猴桃中展青霉素含量和掃面電鏡觀察反式-2-己烯醛處理前后5株擴(kuò)展青霉形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)反式-2-己烯醛不僅能夠使5株擴(kuò)展青霉菌絲出現(xiàn)明顯皺縮、干癟、螺旋等現(xiàn)象，還能夠抑制孢子的繁殖和展青霉素的產(chǎn)生及積累。

研究結(jié)果為獼猴桃的保鮮貯藏及擴(kuò)展青霉污染控制和毒素積累奠定基礎(chǔ)，并為天然抑菌物質(zhì)在農(nóng)產(chǎn)品中實(shí)際應(yīng)用提供一定依據(jù)，但是反式-2-己烯醛對(duì)擴(kuò)展青霉抑菌機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

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Study on inhibitory effect of trans-2-hexenal on growth ofat kiwi fruit storage

Duan Tengfei1,2, Li Zhao1, Yue Tianli1※, Xia Qiuxia1, Meng Jianghong1

(1.,712100,; 2.,234000,)

Patulin is a neurotoxic secondary metabolite that causes a series of acute and chronic conditions such as enteritis, dyspnea and cancer when the body consumes excessive amounts. China is the birthplace of kiwifruit and the largest producer of kiwifruit in the world. A large number of studies had shown that kiwifruit is susceptible to infection with penicillium expansum () and patulin accumulation during harvesting, storage and processing which not only causes waste, but also harms human health. Therefore, it is necessary to study a safe and effective method to controland patulin accumulation of kiwifruit and its products.Trans-2-hexenal is a characteristic aroma component naturally present in kiwi, apple and other fruits. Studies had shown that trans-2-hexenal has a certain inhibitory effect on microorganisms. This article studied the inhibitory effect of hexenal on the growth ofand the production of patulin. Firstly, the five strains of(CICC40658, CGMCC3.3703, LPH6, LPH5, WY) were inoculated into PDA medium plates containing bacteriostatic substance concentration of 5 mg/mL which kept at 28 ℃and the diameter of the colony was measured by the cross method every day.Study the antibacterial effect of trans-2-hexenal and eight antibacterial substances reported in the literature (citric acid, limonene, malic acid,-aminobutyric acid, quercetin, catechin, sodium diacetate, oxalic acid) on 5 strains of. Determined the minimum inhibitory concentration of trans-2-hexenal by antibacterial test of 5 strains ofwhen trans-2-hexenal at a concentration of 40, 60, 80, 100L/L.Then 3 mm of sterile iron nails were used to perforate the equator of kiwifruit and 10L 1.0×106cfu/mL spore suspension of 5 test strains were inoculated which simulating injury of kiwifruit secondary infection. The kiwifruit in vivo test was carried out by adding trans-hexenal aldehyde at a concentration of 100L/L and determined the kiwifruit hardness, soluble solids, titratable acid, reducing sugar, vitamin C, pH value and fruit decay rate to study the effect of trans-2-hexenal on the quality of kiwifruit and the patulin content in kiwifruit was measured by HPLC. Lastly, the effect of trans-2-hexenal on the morphology of 5 strains ofwas observed by scanning electron microscope. The results shown: Compared with the eight antibacterial substances, trans-2-hexenal had the best antibacterial effect and it could completely inhibit the growth of 5 strains of Penicillium expansum. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the five strains was 100, 80, 80, 80 and 80L/L, respectively; trans-2-hexenal significantly reduced the effect ofon kiwi fruit firmness, titratable acid and vitamin C (<0.01)and had no significant effect (>0.01) on the fruit firm, soluble solids, pH value and reducing sugar content of kiwifruit. The rot rate of kiwi fruit withwas reduced and the quality of kiwifruit was better maintained by Trans-2-hexenal. All the aldehyde-treated kiwifruits were not detected by patulin; the scanning electron microscope showed that the five strains showed hyphal shrinkage, folding, drying, and sporulation reduction. Trans-2-hexenal has a good inhibitory effect on the growth ofand the production of patulin and provides a theoretical basis for the development of natural products with antibacterial effects.

fruit;bacteria; storage; trans-2-hexenal;; antibacterial effect; kiwi; patulin

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.02.037

TS255.44

A

1002-6819(2019)-02-0293-09

2018-04-11

2018-12-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371814)；宿州區(qū)域發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心開(kāi)放課題（2016szxt04）

段騰飛，助教，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用。Email：duantf@alu.hit.edu.cn

岳田利，教授, 博士生導(dǎo)師；主要研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)及食品安全控制技術(shù)。Email：yuetl@nwsuaf.edu.cn

段騰飛，李 昭，岳田利，夏秋霞，孟江洪. 反式-2-己烯醛對(duì)獼猴桃貯藏過(guò)程擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)的抑制作用[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2019，35(2)：293－301. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.02.037 http://www.tcsae.org

Duan Tengfei, Li Zhao, Yue Tianli, Xia Qiuxia, Meng Jianghong. Study on inhibitory effect of trans-2-hexenal on growth ofat kiwi fruit storage[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(2): 293－301. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.02.037 http://www.tcsae.org