魏金旺

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠(chǎng)，北京101301）

高溫放線(xiàn)菌屬(Thermoactinomyces)于1899年由Tsiklinsky首次描述，是20世紀(jì)前人類(lèi)所發(fā)現(xiàn)的為數(shù)不多的幾個(gè)放線(xiàn)菌屬之一[1]，其分類(lèi)地位屬于細(xì)菌域（Domain Bacteria）后壁菌門(mén)（Phylum Firmicutes）芽孢桿菌綱（Class Bacilli）芽孢桿菌目（Order Bacillales）高溫放線(xiàn)菌科（Thermoactinomycetaceae），雖然其在形態(tài)學(xué)上接近放線(xiàn)菌，但在分子分類(lèi)上更接近于細(xì)菌類(lèi)群，過(guò)去很多學(xué)者認(rèn)為它是一個(gè)典型的介于細(xì)菌和放線(xiàn)菌之間的特殊類(lèi)群。該類(lèi)微生物在自然界中廣泛分布，常見(jiàn)于高溫環(huán)境，如陸生性熱泉、高溫大曲、堆肥、稻草、甘蔗渣等，可在土壤、水或海洋基質(zhì)中存活[2]。

近幾年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的普及和傳統(tǒng)分離方法的發(fā)展，越來(lái)越多的高溫放線(xiàn)菌類(lèi)群在高溫或中高溫大曲中分離獲得，如劉洋等[3]從芝麻香大曲中分離到1株嗜熱放線(xiàn)菌，并結(jié)合16S rRNA、形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定為普通高溫放線(xiàn)菌（Hermoactinomyces vulgar)；于華等[4]通過(guò)稀釋涂布劃線(xiàn)法、平皿生化反應(yīng)及分子生物學(xué)鑒定，從醬香大曲中分離純化1株高溫放線(xiàn)菌婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei）；李豆南等[5]從高溫醬香大曲中分離到1株耐熱性良好的放線(xiàn)菌，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rRNA分子生物學(xué)鑒定，確定其為糖萊斯氏菌（Laceyella sacchari）。中高溫大曲制曲溫度往往可達(dá)到60℃以上，為高溫放線(xiàn)菌提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，而清香型大曲則屬于中低溫大曲，其制曲溫度往往在40℃左右，目前還尚未見(jiàn)高溫放線(xiàn)菌分離報(bào)道，所以對(duì)清香型大曲進(jìn)行高溫放線(xiàn)菌的研究，有助于解析清香型大曲微生物多樣性，豐富清香型釀酒微生物類(lèi)群。

1 材料與方法

1.1 材料

牛欄山酒廠(chǎng)清香型大曲、發(fā)酵酒醅。

1.2 主要儀器與試劑

BSC-1100ⅡA2型生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；梯度C1000快速梯度基因擴(kuò)增儀，美國(guó)BIORAD公司；基礎(chǔ)型水平電泳儀，美國(guó)BIORAD公司；全自動(dòng)凝膠成像儀，美國(guó)BIORAD公司；1-14k高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；YXQ-LS-75Ⅱ型數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅；SPX-320型生化培養(yǎng)箱，寧波江南；PLR-1006 4℃實(shí)驗(yàn)室冰箱，賽墨飛世爾。

1.3 分離培養(yǎng)基

改良高氏二號(hào)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，胰蛋白胨3 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，水1 L，pH 7.2，營(yíng)養(yǎng)液10 mL，121℃滅菌20 min，冷卻50℃后加入1 mL（50 mg/mL）萘啶酮酸、0.4 mL（20 mg/mL）兩性霉素后傾倒平板。

ISP2培養(yǎng)基：Yeast extract 4 g，Malt extract 5 g，Dextrose 4 g，Agar 18 g，pH7.3，營(yíng)養(yǎng)液10 mL，水1 L，121℃滅菌20 min，冷卻至50℃后加入1 mL（50 mg/mL）萘啶酮酸、0.4 mL（20 mg/mL）兩性霉素后傾倒平板。

ISP5培養(yǎng)基：L-asparagine 1 g，丙三醇 10 g，K2HPO41g，瓊脂 15 g，pH7.2～7.4，營(yíng)養(yǎng)液 10 mL，水1 L，121℃滅菌20 min，冷卻至50℃后，再加入1 mL（50 mg/mL）萘啶酮酸、0.4 mL（20 mg/mL）兩性霉素后傾倒平板。

ISP4培養(yǎng)基：可溶性淀粉10.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，NaCl 1.0 g，(NH4)2SO42.0 g，Ca-CO32.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g，MnCl2·7H2O 0.001 g，瓊脂20.0 g，營(yíng)養(yǎng)液10 mL，水1 L，121℃滅菌20 min，冷卻至50℃后加入1 mL（50 mg/mL）萘啶酮酸、0.4 mL（20 mg/mL）兩性霉素后傾倒平板。

ISP6培養(yǎng)基：細(xì)菌蛋白胨36 g，酵母提取物1 g，pH 7.0～7.2，水1 L，營(yíng)養(yǎng)液10 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻至50℃后加入1 mL（50 mg/mL）萘啶酮酸、0.4 mL（20 mg/mL）兩性霉素后傾倒平板。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，營(yíng)養(yǎng)液10 mL，水1 L，121 ℃滅菌20 min，冷卻50℃后加入1 mL（50 mg/mL）萘啶酮酸、0.4 mL（20 mg/mL）兩性霉素后傾倒平板。

營(yíng)養(yǎng)液：大曲粉10 g，高粱粉10 g，水500 mL，煮沸后過(guò)濾去沉淀，121℃滅菌20 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品采集

采集牛欄山酒廠(chǎng)成品大曲5塊，粉碎后充分混勻，取混合樣品100 g；取牛欄山冬季發(fā)酵時(shí)間為3 d、7 d、13 d、23 d的酒醅各100 g。

1.4.2 微生物分離、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及保藏

樣品預(yù)處理：分別稱(chēng)取大曲、不同發(fā)酵時(shí)間酒醅樣品10 g與90 mL無(wú)菌水混勻，擬定為10-1濃度，55℃、200 r/min水浴30 min，使蘊(yùn)含在樣品中的微生物充分釋放，同時(shí)殺滅不耐高溫的細(xì)菌、真菌等微生物[6]。

微生物分離：采用稀釋涂布法分離，吸取1 mL上述處理好的樣品于9 mL無(wú)菌水中，為10-2，依次稀釋為10-3、10-4梯度。吸取不同梯度液各0.1 mL，涂布相應(yīng)固體分離平板中。

培養(yǎng)：平板于45℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)菌落的生長(zhǎng)情況而定，一般為3～6 d。

挑菌：準(zhǔn)確獲得大曲及酒醅中耐高溫放線(xiàn)菌，挑菌方法為：挑選菌落數(shù)在10～50之間的不同培養(yǎng)基平板，挑取平板內(nèi)所有微生物，其余梯度隨機(jī)挑選多樣性菌落。挑取的菌落接種到相應(yīng)培養(yǎng)基中，45℃培養(yǎng)3～5 d，挑取活化后菌體一環(huán)進(jìn)行DNA提取，其余菌體于-80℃甘油中凍存。

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

DNA提取方法：挑取少量活化的菌體，于已滅過(guò)菌的1.5 mL離心管內(nèi)；加入100 μL裂解液（100 mM Tris，20 mM EDTA，0.5%SDS，pH 8.0，15磅滅菌20 min備用）；100 ℃水浴15 min；加入100 μL 2.5 M的醋酸鉀溶液，冰浴60 min；4℃下12000 r/min離心5 min，取上清液200 μL至0.5 mL離心管中；加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），劇烈振蕩10 min，12000 r/min離心15 min，移取100 μL上清液至0.5 mL離心管中；加入100 μL預(yù)冷的異丙醇，混勻后-20℃下放置20 min；12000 r/min離心15 min，棄上清液；用70%的酒精洗滌沉淀2次；沉淀過(guò)夜自然干燥；加入50 μL已滅菌的超純水，室溫下溶解1 h，-20℃冰箱儲(chǔ)藏備用。

采用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物序列及PCR條件見(jiàn)表1。

表1 PCR引物及反應(yīng)條件

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)合格后，送往北京博邁德公司測(cè)序，測(cè)序后序列用Chromas軟件分析測(cè)序質(zhì)量，去除峰圖不可靠的部分，對(duì)DNA序列進(jìn)行手動(dòng)校正，用校正后的序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進(jìn)行同源序列搜索，比較該菌株在序列上親緣關(guān)系最近的已知信息，包括模式菌株與實(shí)驗(yàn)菌株的堿基差異，近緣模式菌株GenBank序列號(hào)，可以根據(jù)序列同源性初步判斷待測(cè)菌株的分類(lèi)地位。

選取同源性較高的典型菌株作為參比對(duì)象，用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并計(jì)算供試菌株與參比菌株之間的序列相似性。采用鄰接法（Neighbor-Joining），MEGA5.1構(gòu)建供試菌與參比菌之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。用于檢驗(yàn)支持率的重復(fù)抽樣次數(shù)為1000次。

圖1 耐高溫細(xì)菌發(fā)育樹(shù)

表2 高溫放線(xiàn)菌種屬及釀造過(guò)程分布

2 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)中，采用6種分離培養(yǎng)基，從牛欄山大曲及發(fā)酵酒醅中共挑取高溫細(xì)菌類(lèi)微生物265株，由于采取了平板10～50以?xún)?nèi)菌落全部挑取和其余平板隨機(jī)挑菌的方法，因此本次分離能較為全面地獲得了牛欄山大曲及釀造酒醅中耐高溫放線(xiàn)菌細(xì)菌類(lèi)群。通過(guò)純化培養(yǎng)及16S測(cè)序分析后，從265株細(xì)菌微生物中共獲得15種微生物，分別標(biāo)記為GWB1—GWB15，見(jiàn)圖1。

由圖1可看出，在本次樣品中所獲得的15種微生物主要為芽孢桿菌、放線(xiàn)菌和高溫放線(xiàn)菌，將鑒定結(jié)果與分離樣品相對(duì)比，確定高溫放線(xiàn)菌的種屬及在釀造過(guò)程中的分布情況，見(jiàn)表2。

由表2可知，所分離的3種高溫放線(xiàn)菌分別屬于高溫放線(xiàn)菌科，Shimazuella kribbensis屬于島津氏菌屬，目前在白酒釀造中尚未有分離檢測(cè)報(bào)道；Kroppenstedtia sanguinis和Kroppenstedtia eburne同屬于克羅彭斯特菌屬[7-8]，該菌屬在我國(guó)芝麻香白酒中有過(guò)報(bào)道，如姚栗等[9]利用非培養(yǎng)技術(shù)研究芝麻香白酒高溫大曲細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)Kroppenstedtiasp.可占大曲高通量17.38%。

在上述分離結(jié)果中，Shimazuella kribbensis、Kroppenstedtia sanguinis和Kroppenstedtia eburne3種高溫放線(xiàn)菌在清香型大曲中均能夠分離獲得，而在發(fā)酵階段，Kroppenstedtia eburne在發(fā)酵前期3 d和7 d時(shí)可分離得到，其余兩種在發(fā)酵過(guò)程中未能分離得到。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)可以得出，高溫放線(xiàn)菌不單只存在于高溫大曲中，在中低溫清香型大曲中同樣存在，并且在發(fā)酵過(guò)程中可以分離檢測(cè)到。

3 結(jié)論

相對(duì)于酵母菌、細(xì)菌和絲狀真菌，放線(xiàn)菌類(lèi)微生物在白酒研究中報(bào)道較少，作為放線(xiàn)菌的分支耐高溫放線(xiàn)菌，僅在醬香型或芝麻香型白酒中有過(guò)報(bào)道，在清香型白酒中尚未有過(guò)分離報(bào)道。本研究采用傳統(tǒng)分離方法，首次從清香型中低溫大曲和發(fā)酵酒醅中成功分離獲得3種高溫放線(xiàn)菌S.kribbensis、K.sanguinis和K.eburne，豐富了清香型白酒微生物類(lèi)群。同時(shí)，目前已有部分研究結(jié)果表明，部分高溫放線(xiàn)菌往往具有纖維素酶、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、PLA酶等活性，其所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物往往具有復(fù)雜多樣的結(jié)構(gòu)和生理活性[10-11]，因此從清香白酒釀造過(guò)程中分離并鑒定獲得的3類(lèi)高溫放線(xiàn)菌，對(duì)清香型白酒釀造及風(fēng)味研究具有重要的理論研究與實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。